| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 目录 | 第7-11页 |
| 第一章 绪论 | 第11-23页 |
| ·链霉菌胰蛋白酶的概述 | 第11-15页 |
| ·胰蛋白酶的来源及其催化特性 | 第11页 |
| ·胰蛋白酶的功能和应用 | 第11-12页 |
| ·胰蛋白酶的生产 | 第12页 |
| ·链霉菌源胰蛋白酶的产生及结构 | 第12-13页 |
| ·链霉菌源胰蛋白酶的催化机理 | 第13-14页 |
| ·胰蛋白酶活性的定量分析方法 | 第14-15页 |
| ·胰蛋白酶的异源表达研究进展 | 第15-19页 |
| ·动物胰蛋白酶的生产及其异源表达研究 | 第15-16页 |
| ·微生物胰蛋白酶的异源表达研究 | 第16-18页 |
| ·胰蛋白酶异源表达的影响因素 | 第18-19页 |
| ·链霉菌胰蛋白酶工程 | 第19-21页 |
| ·前导肽工程 | 第19-20页 |
| ·链霉菌胰蛋白酶分子改造策略 | 第20-21页 |
| ·本课题的立题依据、研究意义及主要研究内容 | 第21-23页 |
| ·立题依据和研究意义 | 第21-22页 |
| ·主要研究内容 | 第22-23页 |
| 第二章 链霉菌胰蛋白酶在毕赤酵母中的表达及优化 | 第23-42页 |
| ·前言 | 第23页 |
| ·材料与方法 | 第23-31页 |
| ·菌株和质粒 | 第23页 |
| ·试剂和仪器 | 第23-25页 |
| ·培养基及培养条件 | 第25页 |
| ·DNA 操作 | 第25-26页 |
| ·毕赤酵母不同启动子搭配不同重组菌的构建 | 第26-28页 |
| ·胰蛋白酶酶活力测定 | 第28-29页 |
| ·毕赤酵母重组菌的摇瓶发酵及优化 | 第29-30页 |
| ·P. pastoris 重组菌 3 L 罐高密度发酵 | 第30-31页 |
| ·结果与讨论 | 第31-40页 |
| ·P. pastoris 重组菌的构建及验证 | 第31-32页 |
| ·启动子和宿主对 P. pastoris 重组胰蛋白酶的影响 | 第32-34页 |
| ·基因拷贝数及αFactor 信号肽对 P. pastoris 重组菌产胰蛋白酶的影响 | 第34-36页 |
| ·甲醇浓度和诱导温度对 P. pastoris 重组菌产胰蛋白酶的影响 | 第36-37页 |
| ·双碳源混合添加对 P. pastoris 重组菌产胰蛋白酶的影响 | 第37-39页 |
| ·流加甲醇及甲醇-甘油混合物对 P. pastoris 重组菌高密度发酵影响 | 第39-40页 |
| ·本章小结 | 第40-42页 |
| 第三章 链霉菌胰蛋白酶前导肽功能解析及新型胰蛋白酶的设计 | 第42-55页 |
| ·前言 | 第42-43页 |
| ·材料与方法 | 第43-46页 |
| ·菌株和质粒 | 第43页 |
| ·试剂和仪器 | 第43页 |
| ·培养基及培养条件 | 第43页 |
| ·DNA 操作 | 第43-44页 |
| ·链霉菌胰蛋白酶突变体的构建 | 第44-45页 |
| ·胰蛋白酶体外活力测定方法 | 第45页 |
| ·链霉菌胰蛋白酶突变体的纯化 | 第45-46页 |
| ·SDS-PAGE 电泳分析及蛋白浓度测定 | 第46页 |
| ·链霉菌胰蛋白酶突变体蛋白质结构的分子模拟 | 第46页 |
| ·链霉菌胰蛋白酶突变体蛋白质结构分析 | 第46页 |
| ·结果与讨论 | 第46-53页 |
| ·链霉菌胰蛋白酶原前导肽缺失突变体的验证 | 第46-48页 |
| ·链霉菌胰蛋白酶原前导肽缺失突变体的分子模拟及分析 | 第48-50页 |
| ·链霉菌胰蛋白酶前导肽突变体的分子模拟及分析 | 第50-51页 |
| ·链霉菌胰蛋白酶前导肽突变体的验证 | 第51-53页 |
| ·本章小结 | 第53-55页 |
| 第四章 重组链霉菌胰蛋白酶的酶学性质分析 | 第55-69页 |
| ·前言 | 第55页 |
| ·材料与方法 | 第55-57页 |
| ·菌株 | 第55页 |
| ·试剂和仪器 | 第55页 |
| ·培养基及培养条件 | 第55-56页 |
| ·重组链霉菌胰蛋白酶的纯化 | 第56页 |
| ·SDS-PAGE 电泳分析及蛋白浓度测定 | 第56页 |
| ·重组链霉菌胰蛋白酶的最适 pH 及 pH 稳定性 | 第56页 |
| ·重组链霉菌胰蛋白酶的最适温度及温度稳定性 | 第56页 |
| ·金属离子对重组链霉菌胰蛋白酶的影响 | 第56-57页 |
| ·抑制剂和有机溶剂对重组链霉菌胰蛋白酶的影响 | 第57页 |
| ·重组链霉菌胰蛋白酶的酶反应动力学参数 | 第57页 |
| ·重组链霉菌胰蛋白酶蛋白质结构的模拟及分析 | 第57页 |
| ·结果与讨论 | 第57-68页 |
| ·不同来源的胰蛋白酶的分离纯化及 SDS-PAGE 分析 | 第57-58页 |
| ·pH 对重组链霉菌胰蛋白酶的酶活及稳定性的影响 | 第58-60页 |
| ·温度对重组链霉菌胰蛋白酶的酶活及稳定性的影响 | 第60-61页 |
| ·金属离子对重组链霉菌胰蛋白酶的酶活的影响 | 第61-62页 |
| ·抑制剂和有机溶剂对重组链霉菌胰蛋白酶的酶活的影响 | 第62-63页 |
| ·重组链霉菌胰蛋白酶的酶反应动力学参数 | 第63-64页 |
| ·牛胰蛋白酶和野生链霉菌胰蛋白酶性质差异比较分析 | 第64-66页 |
| ·野生和重组链霉菌胰蛋白酶性质差异比较分析 | 第66-68页 |
| ·本章小结 | 第68-69页 |
| 第五章 自降解位点 R145 突变体的构建及其催化特性和表达分析 | 第69-79页 |
| ·前言 | 第69页 |
| ·材料与方法 | 第69-71页 |
| ·菌株 | 第69页 |
| ·试剂和仪器 | 第69页 |
| ·培养基及培养条件 | 第69-70页 |
| ·重组链霉菌胰蛋白酶 R145 突变体酶活测定 | 第70页 |
| ·重组链霉菌胰蛋白酶 R145 突变体的纯化 | 第70页 |
| ·SDS-PAGE 电泳分析及蛋白浓度测定 | 第70页 |
| ·重组链霉菌胰蛋白酶 R145 突变体的酶反应动力学参数 | 第70页 |
| ·重组链霉菌胰蛋白酶 R145 突变体的抗自降解验证 | 第70页 |
| ·重组链霉菌胰蛋白酶 R145 突变体蛋白质结构的模拟及分析 | 第70页 |
| ·链霉菌胰蛋白酶 R145 突变体的高密度发酵 | 第70-71页 |
| ·结果与讨论 | 第71-78页 |
| ·重组链霉菌胰蛋白酶 R145 突变菌株的获得及验证 | 第71页 |
| ·野生及重组链霉菌胰蛋白酶菌株的摇瓶发酵比较 | 第71-72页 |
| ·野生及重组链霉菌胰蛋白酶的纯化和 SDS-PAGE 分析 | 第72-73页 |
| ·野生及重组链霉菌胰蛋白酶的酰胺酶和酯酶比酶活的比较 | 第73-74页 |
| ·野生及重组链霉菌胰蛋白酶的酶反应动力学参数的比较 | 第74页 |
| ·野生及重组链霉菌胰蛋白酶的抗自降解比较 | 第74-75页 |
| ·野生及链霉菌胰蛋白酶 Exmt(R145I)的模拟结构比较 | 第75-76页 |
| ·链霉菌胰蛋白酶 Exmt(R145I)重组菌的 3 L 罐高密度发酵 | 第76-78页 |
| ·本章小结 | 第78-79页 |
| 第六章 链霉菌胰蛋白酶自活化融合突变体的构建及其表达分析 | 第79-91页 |
| ·前言 | 第79-80页 |
| ·材料与方法 | 第80-81页 |
| ·菌株 | 第80页 |
| ·试剂和仪器 | 第80页 |
| ·培养基及培养条件 | 第80页 |
| ·胰蛋白酶酶活的测定 | 第80页 |
| ·链霉菌胰蛋白酶突变体的 SDS-PAGE 分析 | 第80页 |
| ·链霉菌胰蛋白酶突变体 VD4Kmt 的体外激活 | 第80页 |
| ·链霉菌胰蛋白酶突变体蛋白质结构的模拟及分析 | 第80页 |
| ·链霉菌胰蛋白酶自活化突变体产生菌的高密度发酵 | 第80-81页 |
| ·结果与讨论 | 第81-90页 |
| ·链霉菌胰蛋白酶突变体 VD4Kmt 的构建和验证 | 第81-82页 |
| ·杂交链霉菌胰蛋白酶 VD4Kmt 的体外激活 | 第82-83页 |
| ·杂交链霉菌胰蛋白酶 VD4Kmt 的模拟结构分析 | 第83-84页 |
| ·自活化融合突变体 TLmt(D4K)的构建和验证 | 第84-85页 |
| ·自活化融合突变体 TLmt(D4K)的模拟结构分析 | 第85-86页 |
| ·融合突变体 TLmt(D4K)自活化的 SDS-PAGE 验证 | 第86-87页 |
| ·自活化融合突变体的设计及验证 | 第87-88页 |
| ·自活化融合突变体 TLmt(D4K)的 3 L 罐高密度发酵 | 第88-90页 |
| ·本章小结 | 第90-91页 |
| 主要结论及展望 | 第91-93页 |
| 主要结论 | 第91-92页 |
| 展望 | 第92-93页 |
| 论文主要创新点 | 第93-94页 |
| 致谢 | 第94-95页 |
| 参考文献 | 第95-102页 |
| 附录: 作者在攻读博士学位期间发表论文 | 第102-103页 |
| 附录: 英文缩略语注释 | 第103-104页 |
| 附录: 氨基酸名称中英文对照 | 第104-105页 |
| 附录: Britton-Robinson pH 缓冲液配制 | 第105页 |
