| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-13页 |
| 第一章 绪论 | 第13-33页 |
| ·前言 | 第13-15页 |
| ·糖尿病 | 第13页 |
| ·胰岛素 | 第13-15页 |
| ·胰岛素的研究进展 | 第15-17页 |
| ·重组人胰岛素的研究 | 第17-26页 |
| ·人胰岛素原在大肠杆菌中的表达 | 第17-24页 |
| ·用大肠杆菌进行基因表达的一般策略 | 第18页 |
| ·影响基因重组蛋白质在大肠杆菌中表达的因素 | 第18-22页 |
| ·外源蛋白在大肠杆菌中的表达形式 | 第22-24页 |
| ·人胰岛素原在酵母中的表达 | 第24-26页 |
| ·人胰岛素原在酿酒酵母中的表达 | 第24-25页 |
| ·人胰岛素原在巴斯德毕赤酵母中的表达 | 第25-26页 |
| ·重组蛋白包涵体的研究 | 第26-30页 |
| ·包涵体形成的原因 | 第26页 |
| ·包涵体的性质 | 第26-27页 |
| ·包涵体形成的生物学意义 | 第27页 |
| ·包涵体的分离提取 | 第27-28页 |
| ·包涵体的溶解 | 第28-29页 |
| ·包涵体的复性和纯化 | 第29-30页 |
| ·基因工程重组蛋白下游纯化技术 | 第30-33页 |
| ·离子交换层析 | 第30-31页 |
| ·金属螯合亲和层析 | 第31页 |
| ·疏水层析 | 第31-32页 |
| ·凝胶过滤层析 | 第32页 |
| ·亲和层析(AC) | 第32-33页 |
| 第二章 基因工程菌的构建 | 第33-37页 |
| ·引言 | 第33页 |
| ·重组人胰岛素基因工程菌的构建 | 第33-34页 |
| ·质粒的提取及转化 | 第34-35页 |
| ·实验材料 | 第34页 |
| ·质粒的提取 | 第34页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第34-35页 |
| ·质粒的转化 | 第35页 |
| ·保存菌种 | 第35页 |
| ·小结 | 第35-37页 |
| 第三章 重组人胰岛素基因工程菌发酵条件的研究 | 第37-49页 |
| ·引言 | 第37页 |
| ·试验材料与仪器 | 第37-38页 |
| ·试验材料 | 第37-38页 |
| ·菌种 | 第37页 |
| ·培养基 | 第37-38页 |
| ·实验仪器 | 第38页 |
| ·实验方法 | 第38-39页 |
| ·菌种活化 | 第38页 |
| ·菌种培养 | 第38-39页 |
| ·菌种的筛选 | 第39页 |
| ·发酵过程各因素的影响 | 第39-40页 |
| ·培养时间对基因工程菌生长的影响 | 第39页 |
| ·诱导条件的影响 | 第39-40页 |
| ·分析方法 | 第40页 |
| ·菌体浓度的测定 | 第40页 |
| ·目的蛋白纯度测定 | 第40页 |
| ·实验结果与分析 | 第40-47页 |
| ·基因工程菌的生长 | 第40-41页 |
| ·不同菌种融合蛋白表达量分析 | 第41-42页 |
| ·不同诱导条件对融合蛋白表达量的影响 | 第42-46页 |
| ·不同诱导温度对融合蛋白表达量的影响 | 第42-43页 |
| ·不同诱导时间对融合蛋白表达量的影响 | 第43-44页 |
| ·不同 IPTG浓度对融合蛋白表达量的影响 | 第44-45页 |
| ·Kana浓度对融合蛋白表达量的影响 | 第45-46页 |
| ·正交实验结果分析 | 第46-47页 |
| ·本章小结 | 第47-49页 |
| 第四章 包涵体的分离和洗涤条件研究 | 第49-55页 |
| ·引言 | 第49页 |
| ·实验材料和仪器 | 第49-50页 |
| ·实验材料 | 第49页 |
| ·实验仪器 | 第49-50页 |
| ·实验方法 | 第50页 |
| ·菌体收集与洗涤 | 第50页 |
| ·菌体破碎 | 第50页 |
| ·包涵体洗涤 | 第50页 |
| ·分析方法 | 第50-51页 |
| ·目的蛋白浓度测定 | 第51页 |
| ·结果与讨论 | 第51-54页 |
| ·菌体洗涤次数对杂蛋白去除的影响 | 第51页 |
| ·洗涤纯化对包涵体得率与纯度的影响 | 第51-54页 |
| ·洗涤缓冲液对包涵体纯度的影响 | 第51-52页 |
| ·洗涤次数对包涵体纯度的影响 | 第52-54页 |
| ·本章小结 | 第54-55页 |
| 第五章 重组人胰岛素原变性复性条件研究 | 第55-65页 |
| ·引言 | 第55页 |
| ·实验材料和仪器 | 第55-56页 |
| ·实验材料 | 第55-56页 |
| ·实验仪器 | 第56页 |
| ·实验方法 | 第56-58页 |
| ·包涵体的溶解变性 | 第56页 |
| ·CNBr裂解 | 第56-57页 |
| ·包涵体变性液的复性研究 | 第57-58页 |
| ·复性液转化体系缓冲液的比较 | 第58页 |
| ·分析方法 | 第58页 |
| ·目的蛋白纯度测定 | 第58页 |
| ·高效液相色谱鉴定融合蛋白的含量 | 第58页 |
| ·结果与分析 | 第58-63页 |
| ·DTT对变性的影响 | 第58-59页 |
| ·CNBr裂解变性液的 SDS-PAGE分析 | 第59页 |
| ·不同复性条件对重组人胰岛素原复性的影响 | 第59-62页 |
| ·氧化还原环境对复性的影响 | 第60页 |
| ·pH值对复性的影响 | 第60-61页 |
| ·小分子添加剂对复性的影响 | 第61-62页 |
| ·复性方法对复性的影响 | 第62-63页 |
| ·缓冲体系对复性液的影响 | 第63页 |
| ·本章小结 | 第63-65页 |
| 第六章 重组人胰岛素原分离纯化的研究 | 第65-71页 |
| ·引言 | 第65页 |
| ·实验材料和仪器 | 第65页 |
| ·实验材料 | 第65页 |
| ·实验仪器 | 第65页 |
| ·实验方法 | 第65-66页 |
| ·DEAE离子交换层析 | 第65-66页 |
| ·Ni-Sepharose亲和层析 | 第66页 |
| ·分析方法 | 第66页 |
| ·SDS-PAGE凝胶电泳 | 第66页 |
| ·实验结果与分析 | 第66-69页 |
| ·DEAE离子交换层析 | 第66-68页 |
| ·金属螯合层析 | 第68-69页 |
| ·本章小结 | 第69-71页 |
| 第七章 重组人胰岛素原的酶切及进一步分离纯化的研究 | 第71-77页 |
| ·引言 | 第71页 |
| ·实验材料和仪器 | 第71页 |
| ·实验材料 | 第71页 |
| ·实验仪器 | 第71页 |
| ·实验方法 | 第71-72页 |
| ·酶切 | 第72页 |
| ·胰岛素的后处理 | 第72页 |
| ·疏水层析 | 第72页 |
| ·Sephadex-G25凝胶层析 | 第72页 |
| ·Zn2Cl沉淀与结晶 | 第72页 |
| ·分析方法 | 第72-73页 |
| ·SDS-PAGE电泳分析 | 第72页 |
| ·HPLC分析 | 第72-73页 |
| ·结果与讨论 | 第73-76页 |
| ·不同胰蛋白酶对酶切的影响 | 第73页 |
| ·加入酶量对酶切的影响 | 第73-74页 |
| ·酶切后蛋白的纯化 | 第74-76页 |
| ·疏水层析(HIC) | 第74-75页 |
| ·Sephadex-G25 | 第75-76页 |
| ·胰岛素结晶 | 第76页 |
| ·本章小结 | 第76-77页 |
| 第八章 结论与建议 | 第77-79页 |
| ·结论 | 第77-78页 |
| ·建议 | 第78-79页 |
| 参考文献 | 第79-83页 |
| 附录 | 第83-87页 |
| 附录一 各种试剂的配制 | 第83-86页 |
| 附录二 培养基 | 第86-87页 |
| 致谢 | 第87-89页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 | 第89-91页 |
| 作者和导师简介 | 第91-92页 |
| 附件 | 第92-93页 |