| 目录 | 第1-6页 |
| 中文摘要 | 第6-7页 |
| 英文摘要 | 第7-9页 |
| 缩略语 | 第9-11页 |
| 一、引言 | 第11-14页 |
| 二、材料与方法 | 第14-37页 |
| 1 材料 | 第14-17页 |
| ·动物: | 第14页 |
| ·主要仪器 | 第14-15页 |
| ·主要试剂: | 第15-17页 |
| ·逆转录、cDNA克隆、载体构建试剂 | 第15-16页 |
| ·蛋白分析试剂 | 第16-17页 |
| ·高效液相色谱材料 | 第17页 |
| 2 方法 | 第17-37页 |
| ·兔NRDR编码区cDNA克隆及载体构建 | 第17-23页 |
| ·组织 | 第17页 |
| ·提取兔肝总RNA | 第17-18页 |
| ·兔NRDR RNA逆转录成cDNA | 第18-19页 |
| ·PCR扩增兔NRDR cDNA | 第19-20页 |
| ·胶回收目的片段 | 第20页 |
| ·将目的片段连接至pGEM-T质粒 | 第20-21页 |
| ·转化 | 第21-22页 |
| ·重组质粒的初步筛选 | 第22-23页 |
| ·测序确认 | 第23页 |
| ·兔NRDR表达载体的构建 | 第23-28页 |
| ·提取重组质粒 | 第24-25页 |
| ·扩增出带attB重组位点的NRDR PCR片段 | 第25-26页 |
| ·入门克隆的构建 | 第26-27页 |
| ·入门克隆的筛选 | 第27页 |
| ·表达克隆的构建 | 第27-28页 |
| ·兔NRDR在BL21-AI~(TM)细胞中的表达及性质鉴定 | 第28-33页 |
| ·试剂的配制 | 第28-30页 |
| ·绘制蛋白浓度标准曲线 | 第30-31页 |
| ·蛋白电泳 | 第31页 |
| ·确定最佳表达时间 | 第31页 |
| ·确定蛋白表达形式 | 第31-32页 |
| ·通过westren-blot进一步确定蛋白表达形式 | 第32页 |
| ·表达蛋白活性的测定 | 第32-33页 |
| ·兔NRDR的纯化及Km值测定 | 第33-35页 |
| ·表达蛋白的纯化 | 第33-34页 |
| ·纯化蛋白Km值的测定 | 第34-35页 |
| ·兔NRDR多克隆抗体的制备 | 第35-37页 |
| 三、结果 | 第37-48页 |
| 1 兔NRDR编码区cDNA的克隆及载体构建 | 第37-39页 |
| ·总RNA浓度 | 第37页 |
| ·全长cDNA的克隆 | 第37页 |
| ·NRDR全长序列载体的构建 | 第37-38页 |
| ·测序确认NRDR全长序列 | 第38-39页 |
| 2 带兔NRDR编码区表达载体的构建 | 第39-40页 |
| ·扩增出带attB重组位点的PCR产物 | 第39页 |
| ·菌落PCR确认入门克隆 | 第39-40页 |
| ·测序确认入门克隆 | 第40页 |
| ·菌落PCR确认表达克隆 | 第40页 |
| 3 兔NRDR在BL21-AI~(TM)细胞中的表达 | 第40-43页 |
| ·蛋白浓度标准曲线的建立 | 第40-41页 |
| ·确认蛋白最佳表达时间 | 第41页 |
| ·确认蛋白表达形式 | 第41-42页 |
| ·表达蛋白的活性测定 | 第42-43页 |
| 4 兔NRDR原核表达蛋白的纯化及Km值测定 | 第43-46页 |
| ·表达蛋白的纯化 | 第43-44页 |
| ·表达蛋白纯化效率 | 第44页 |
| ·纯化蛋白活性测定 | 第44-46页 |
| ·视黄醇、视黄醛浓度-HPLC峰面积标准曲线的建立 | 第44页 |
| ·Km值测定 | 第44-46页 |
| 5 豚鼠抗兔NRDR多克隆抗体的制备 | 第46-48页 |
| ·豚鼠血清抗体滴度分析 | 第46页 |
| ·Western-Blot分析 | 第46-48页 |
| 四、讨论 | 第48-51页 |
| 五、结论 | 第51-52页 |
| 六、参考文献 | 第52-58页 |
| 七、致谢 | 第58页 |
