| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-11页 |
| 前言 | 第11-26页 |
| 第一部分 葡萄球菌肠毒素B(SEB)及组氨酸替代突变体的抗肿瘤作用研究 | 第26-46页 |
| 实验研究一 组氨酸替代突变体的表达纯化 | 第26-34页 |
| 1.材料与方法 | 第26-30页 |
| ·实验材料 | 第26-27页 |
| ·主要实验方法 | 第27-30页 |
| 2.实验结果 | 第30-32页 |
| ·重组突变体的诱导表达 | 第30-31页 |
| ·离子交换色谱纯化 | 第31页 |
| ·各突变体蛋白的Western-Blotting鉴定 | 第31-32页 |
| 3.讨论 | 第32-34页 |
| 实验研究二 组氨酸替代突变体的减毒作用分析与抗肿瘤作用研究 | 第34-46页 |
| 1.材料与方法 | 第34-38页 |
| ·实验动物和细胞株 | 第34页 |
| ·主要试剂、仪器 | 第34-35页 |
| ·主要实验方法 | 第35-38页 |
| 2.实验结果 | 第38-43页 |
| ·体外肿瘤杀伤实验 | 第38-39页 |
| ·乳猫催吐实验 | 第39-41页 |
| ·MHCⅡ类分子结合实验 | 第41页 |
| ·体内抑瘤实验 | 第41-43页 |
| 3.小结 | 第43页 |
| 4.讨论 | 第43-46页 |
| 第二部分 抗肝癌单链抗体(scFv)靶向超抗原SEB的构建与活性评价 | 第46-87页 |
| 实验研究一 融合蛋白的初步生物信息学设计与分析 | 第47-51页 |
| 1.实验材料 | 第47页 |
| 2.实验方法 | 第47页 |
| ·可及性(Accessibility)和柔性(Flexibility)分析 | 第47页 |
| ·抗原性(Antigenicity)和疏水性(Hydrophobicity)分析 | 第47页 |
| ·二级结构预测与分析 | 第47页 |
| 3.实验结果 | 第47-49页 |
| ·可及性和柔性分析结果 | 第47-48页 |
| ·抗原性和疏水性分析结果 | 第48-49页 |
| ·二级结构预测结果 | 第49页 |
| 4.讨论 | 第49-51页 |
| 实验研究二 系列抗体靶向超抗原的构建、表达与筛选 | 第51-65页 |
| 1.材料与方法 | 第51-57页 |
| ·菌株和质粒 | 第51页 |
| ·试剂和溶液 | 第51-52页 |
| ·主要仪器 | 第52页 |
| ·引物设计与合成 | 第52-54页 |
| ·单链抗体靶向超抗原的基因扩增 | 第54页 |
| ·抗肝癌单链抗体靶向超抗原融合分子克隆载体的构建和鉴定 | 第54-55页 |
| ·抗肝癌单链抗体靶向超抗原融合分子表达载体的构建和鉴定 | 第55页 |
| ·不溶性蛋白的变复性 | 第55-56页 |
| ·系列抗肝癌单链抗体靶向超抗原融合分子的筛选 | 第56-57页 |
| 2.实验结果 | 第57-64页 |
| ·靶向超抗原融合分子的构建与鉴定 | 第57页 |
| ·融合分子的诱导表达与表达形式鉴定 | 第57-62页 |
| ·包涵体蛋白的变性复性 | 第62页 |
| ·融合蛋白分子的筛选 | 第62-64页 |
| 3.小结 | 第64-65页 |
| 实验研究三 单链抗体靶向超抗原SEB的构建、表达与纯化 | 第65-74页 |
| 1.材料与方法 | 第65-67页 |
| ·引物 | 第65-66页 |
| ·scFv-SEB-6xHis tag-pTIG-Trx的构建与鉴定 | 第66页 |
| ·Western blot鉴定 | 第66页 |
| ·scFv-SEB-His tag的金属螯合层析纯化与脱盐 | 第66-67页 |
| 2.结果 | 第67-71页 |
| ·scFv-SEB-6xHis tag-pTIG-Trx的构建与鉴定 | 第67-68页 |
| ·重组表达质粒在大肠杆菌中的诱导表达和表达形式分析 | 第68-69页 |
| ·重组蛋白的Western blot鉴定 | 第69页 |
| ·重组蛋白的纯化与脱盐 | 第69-71页 |
| 3.小结 | 第71页 |
| 4.讨论 | 第71-74页 |
| 实验研究四 单链抗体靶向超抗原scFv-SEB的抗肝癌效应评价 | 第74-87页 |
| 1.材料与方法 | 第74-76页 |
| ·细胞和试剂 | 第74页 |
| ·细胞的包被 | 第74页 |
| ·淋巴细胞分离方法 | 第74-75页 |
| ·细胞ELISA测定重组蛋白的稳定性和抗体的体外结合活性 | 第75页 |
| ·细胞免疫组化法检测单链抗体靶向超抗原SEB与肝癌细胞系SMMC-7721的 结合能力。 | 第75页 |
| ·MTS比色法测定重组蛋白的细胞杀伤活性检测 | 第75-76页 |
| ·乳酸脱氢酶(LDH)法测定重组蛋白的SACCC作用 | 第76页 |
| 2.结果 | 第76-84页 |
| ·细胞ELISA测定的体外结合活性 | 第76-79页 |
| ·免疫细胞化学检测scFv-SEB对SMMC-7721的结合活性 | 第79页 |
| ·细胞ELISA测定scFv-SEB的稳定性 | 第79-80页 |
| ·scFv-SEB对SMMC-7721的细胞杀伤活性检测 | 第80-83页 |
| ·LDH法结合HLA-DR抗体封闭实验检测SADCC作用 | 第83-84页 |
| 3.小结 | 第84-85页 |
| 4.讨论 | 第85-87页 |
| 第三部分 二硫键稳定抗体靶向超抗原SEB(dsFv-SEB)的构建与鉴定 | 第87-99页 |
| 1.材料与方法 | 第87-90页 |
| ·菌株、质粒、试剂与溶液 | 第87页 |
| ·引物设计与合成 | 第87-88页 |
| ·PCR扩增 | 第88页 |
| ·PCR产物的回收与纯化,T载体连接与鉴定,序列测序确证,表达载体的构建与鉴定等 | 第88页 |
| ·工程菌的诱导表达与表达形式鉴定 | 第88-89页 |
| ·包涵体的洗涤及变复性 | 第89页 |
| ·复性产物的纯化 | 第89-90页 |
| ·细胞ELISA | 第90页 |
| 2.实验结果 | 第90-96页 |
| ·抗肝癌单链二硫键稳定抗体的扩增 | 第90页 |
| ·表达载体的酶切鉴定 | 第90-91页 |
| ·蛋白的诱导表达 | 第91-92页 |
| ·包涵体的洗涤 | 第92页 |
| ·包涵体的纯化与二硫键形成鉴定 | 第92-93页 |
| ·不同VH、VL组合以及变复性条件对形成dsFv的影响 | 第93-95页 |
| ·复性后dsFv-SEB的结合活性与稳定性检测 | 第95-96页 |
| 3.小结 | 第96页 |
| 4.讨论 | 第96-99页 |
| 结论 | 第99-100页 |
| 参考文献 | 第100-112页 |
| 致谢 | 第112-113页 |
| 附录 | 第113-115页 |
| 在学期间主要发表或待发表的文章: | 第115-116页 |
| 专利申请情况: | 第116页 |
| 在学期间参加完成的主要工作: | 第116-117页 |
| 综述 | 第117-120页 |
