| 中文摘要 | 第1-16页 |
| 英文摘要 | 第16-20页 |
| 1 引 言 | 第20-49页 |
| ·RNA 沉默的生物学机制及其应用 | 第20-47页 |
| ·RNA 沉默现象 | 第20-22页 |
| ·植物中的 PTGS | 第20-22页 |
| ·真菌中的 QUELLING | 第22页 |
| ·动物中的 RNAi | 第22页 |
| ·RNA 沉默的重要特征 | 第22-25页 |
| ·SiRNA | 第24页 |
| ·沉默信号的扩大和系统传播 | 第24-25页 |
| ·RNA 沉默的组分 | 第25-32页 |
| ·Dicer | 第25-27页 |
| ·引导 RNA和RNA沉默复合体(RISC) | 第27-28页 |
| ·RNA 和 DNA 解旋酶类 | 第28-29页 |
| ·翻译起始因子 | 第29-30页 |
| ·RNA 依赖的 RNA 聚合酶(RdRP) | 第30-31页 |
| ·通道蛋白 | 第31页 |
| ·未知功能蛋白 | 第31-32页 |
| ·RNA 沉默的机制 | 第32-35页 |
| ·dsRNA 的产生 | 第32页 |
| ·siRNA 的形成 | 第32-34页 |
| ·siRNA 的扩增 | 第34页 |
| ·mRNA 的降解 | 第34-35页 |
| ·RNA 沉默与植物病毒 | 第35-43页 |
| ·病毒诱发的基因沉默 | 第35-39页 |
| ·病毒对RNA沉默的抑制 | 第39-41页 |
| ·RNA 介导的病毒抗性 | 第41-43页 |
| ·RNA 介导抗病性的发现 | 第41-42页 |
| ·RNA 介导抗病性的特点 | 第42-43页 |
| ·RNA 沉默的生物学意义 | 第43-44页 |
| ·RNA 沉默是生物体抵抗病毒的防御机制 | 第43-44页 |
| ·RNA 沉默与生物生长发育密切相关 | 第44页 |
| ·抑制转座子的运动 | 第44页 |
| ·RNA 沉默的应用 | 第44-47页 |
| ·RNA 沉默用于功能基因组研究 | 第44-46页 |
| ·RNA 沉默在动物功能基因研究中的应用 | 第45页 |
| ·RNA 沉默在植物功能基因研究中的应用 | 第45-46页 |
| ·开展基因治疗的新策略 | 第46-47页 |
| ·本研究的立题依据 | 第47-49页 |
| 2 研究报告 | 第49-106页 |
| 第一章 非翻译PVY~N-CP和PVX-CP以不同片段长度和顺序组成嵌合基因转化烟草的抗病性研究 | 第49-82页 |
| ·材料与方法 | 第49-65页 |
| ·材 料 | 第49页 |
| ·毒源 | 第49页 |
| ·供试植物 | 第49页 |
| ·菌株、质粒和试剂 | 第49页 |
| ·方 法 | 第49-65页 |
| ·嵌合基因XY、fXY、YX、fYX所需目的片段的获得 | 第49-53页 |
| ·嵌合基因XY、fXY目的片段的连接方式、酶切位点及引物组合 | 第49-50页 |
| ·嵌合基因YX、fYX目的片段的连接方式、酶切位点及引物组合 | 第50页 |
| ·非翻译PVX-CP全长及3′ 端基因片段的引物设计 | 第50页 |
| ·非翻译PVY-CP全长及3′ 端基因片段的引物设计 | 第50-51页 |
| ·目的基因的PCR扩增 | 第51页 |
| ·PCR 产物的纯化 | 第51页 |
| ·PCR 产物的单酶切 | 第51-52页 |
| ·嵌合基因 XY、fXY、YX和fYX的体外连接 | 第52-53页 |
| ·克隆(表达)载体DNA的制备 | 第53-55页 |
| ·质粒DNA的提取 | 第53-55页 |
| ·克隆(表达)载体质粒DNA酶切脱磷 | 第55页 |
| ·目的片段与克隆(表达)载体的连接 | 第55页 |
| ·质粒DNA向大肠杆菌中的转化 | 第55-56页 |
| ·大肠杆菌 DH5α 感受态细胞的制备 | 第55-56页 |
| ·质粒 DNA 向大肠杆菌中的转化(热激法) | 第56页 |
| ·转化菌落的鉴定 | 第56-57页 |
| ·PCR 鉴定 | 第56页 |
| ·少量提取重组质粒DNA的酶切鉴定 | 第56-57页 |
| ·大量提取重组质粒DNA的酶切鉴定 | 第57页 |
| ·基因序列测定 | 第57页 |
| ·植物表达载体的构建 | 第57页 |
| ·重组植物表达载体向农杆菌中的转化(冻融法) | 第57页 |
| ·农杆菌介导的外源基因向烟草中转化及转化植株的获得 | 第57-58页 |
| ·转化植株的卡那霉素抗性筛选鉴定及扩繁 | 第58页 |
| ·转化植株的 DNA提取及PCR检测 | 第58-59页 |
| ·转化植株的 DNA 提取(CTAB 法) | 第58-59页 |
| ·转化植株的PCR检测 | 第59页 |
| ·转基因植株的抗病性鉴定及ELISA检测 | 第59-60页 |
| ·转基因植株的抗病性鉴定 | 第59页 |
| ·ELISA 检测 | 第59-60页 |
| ·转基因植株的 Southern blot 分析 | 第60-62页 |
| ·植物总DNA的酶切 | 第60页 |
| ·DNA 凝胶电泳 | 第60页 |
| ·转膜 | 第60-61页 |
| ·探针的制备 | 第61-62页 |
| ·杂交 | 第62页 |
| ·转基因植株总RNA的提取及Northern blot分析 | 第62-65页 |
| ·转基因植株总RNA的提取(异硫氰酸胍法) | 第62-63页 |
| ·在含有甲醛的凝胶上进行RNA电泳 | 第63-64页 |
| ·转膜 | 第64页 |
| ·探针的制备 | 第64页 |
| ·杂交 | 第64-65页 |
| ·结果与分析 | 第65-82页 |
| ·嵌合基因所需目的片段的获得及载体的构建 | 第65-72页 |
| ·嵌合基因所需目的片段的获得 | 第65-66页 |
| ·质粒DNA的酶切、脱磷及回收 | 第66页 |
| ·目的基因与克隆载体的连接及重组质粒的鉴定 | 第66-69页 |
| ·目的基因与克隆载体的连接及重组质粒的PCR鉴定 | 第66-67页 |
| ·少量提取重组克隆质粒酶切鉴定 | 第67-69页 |
| ·大量提取重组克隆质粒酶切鉴定 | 第69页 |
| ·嵌合基因序列测定 | 第69-72页 |
| ·植物表达载体的构建 | 第72-74页 |
| ·转化植株的获得 | 第74页 |
| ·转化植株的PCR检测 | 第74-76页 |
| ·转基因植株的抗病性分析 | 第76-80页 |
| ·转基因植株的 Southern blot 分析 | 第80-81页 |
| ·转基因(非转基因)植株DNA的酶切 | 第80页 |
| ·转基因植株的 Southern blot 分析 | 第80-81页 |
| ·转基因植株的 Northern blot 分析 | 第81-82页 |
| 第二章 PVY~N-CP 3′ 端基因片段和 PVX-CP 3′ 端基因片段组成嵌合基因构建 Hairpin结构基因转化烟草的抗病性研究 | 第82-106页 |
| ·材料与方法 | 第82-89页 |
| ·材 料 | 第82页 |
| ·毒源 | 第82页 |
| ·供试植物 | 第82页 |
| ·菌株、质粒和试剂 | 第82页 |
| ·方 法 | 第82-89页 |
| ·带有内含子的Hairpin结构植物表达载体的构建 | 第82-86页 |
| ·载体构建原理 | 第82-83页 |
| ·嵌合基因X200Y200、Y200X200及克隆载体的构建 | 第83-84页 |
| ·嵌合基因 X200Y200和 Y200X200的序列测定 | 第84-85页 |
| ·带有内含子的Hairpin结构植物表达载体的构建 | 第85-86页 |
| ·Hairpin 结构植物表达载体的构建 | 第86-87页 |
| ·嵌合基因 X200Y200和 Y200X200及克隆载体的构建 | 第86页 |
| ·嵌合基因 X250Y200和 Y250X200及克隆载体的构建 | 第86-87页 |
| ·嵌合基因 X250Y200和 Y250X200的序列测定 | 第87页 |
| ·Hairpin 结构植物表达载体的构建 | 第87页 |
| ·重组植物表达载体向农杆菌中转化(冻融法) | 第87页 |
| ·农杆菌介导的外源基因向烟草中转化及转化植株的获得 | 第87页 |
| ·转化植株的抗性筛选鉴定及扩繁 | 第87页 |
| ·转化植株DNA提取及 PCR检测 | 第87页 |
| ·转基因烟草的抗病性鉴定及ELISA检测 | 第87-88页 |
| ·转基因烟草的 Southern blot 分析 | 第88页 |
| ·转基因烟草总 RNA 的提取及 Northern blot 分析 | 第88-89页 |
| ·结果与分析 | 第89-103页 |
| ·带有内含子的 Hairpin 结构植物表达载体的构建 | 第89-92页 |
| ·嵌合基因的克隆 | 第89页 |
| ·嵌合基因序列测定 | 第89-90页 |
| ·带有内含子的Hairpin结构植物表达载体的构建 | 第90-92页 |
| ·Hairpin 结构植物表达载体的构建 | 第92-95页 |
| ·嵌合基因 X200Y200和 Y200X200及克隆载体的构建 | 第92页 |
| ·嵌合基因 X250Y200、Y250X200、克隆载体及表达载体的构建 | 第92-95页 |
| ·嵌合基因 X250Y200和 Y250X200及克隆载体的构建 | 第92-93页 |
| ·嵌合基因序列测定 | 第93-94页 |
| ·克隆载体 pUCX200Y200Y250X200和 pUCY200X200X250Y200的构建 | 第94页 |
| ·植物表达载体的构建 | 第94-95页 |
| ·转化植株的获得 | 第95页 |
| ·带有内含子的Hairpin结构植物表达载体向植物中的转化 | 第95页 |
| ·Hairpin 结构植物表达载体向植物中的转化 | 第95页 |
| ·转化植株的PCR检测 | 第95-98页 |
| ·转化烟草植株的总DNA提取 | 第95-96页 |
| ·转化植株的PCR检测 | 第96-98页 |
| ·转化pFXYiYX和pFYXiXY的植株PCR检测 | 第96-97页 |
| ·转化pXY?YX和pYX?XY的植株PCR检测 | 第97-98页 |
| ·转基因植株的抗病性分析 | 第98-103页 |
| ·转化pFXYiYX和pFYXiXY的转基因植株的抗病性分析 | 第98-99页 |
| ·转化pXY?YX和pYX?XY的转基因植株抗病性分析 | 第99-103页 |
| ·转基因植株的 Southern blot 分析 | 第103-104页 |
| ·转化 pXY?YX 的转基因植株的 Southern blot 分析 | 第103-104页 |
| ·转化pYX?XY的转基因植株的Southern blot分析 | 第104页 |
| ·转基因植株的 Northern blot 分析 | 第104-106页 |
| ·转化pXY?YX的转基因植株的Northern blot分析 | 第104-105页 |
| ·转化pYX?XY的转基因植株的Northern blot分析 | 第105-106页 |
| 3 讨 论 | 第106-110页 |
| ·非翻译 PVY~N-CP和 PVX-CP以不同片段长度和顺序连接组成嵌合基因转化烟草的抗病性研究 | 第106-108页 |
| ·PVY~N-CP 3′ 端基因片段和 PVX-CP 3′ 端基因片段组成嵌合基因构建 Hairpin 结构基因转化烟草的抗病性研究 | 第108-109页 |
| ·以不同顺序连接构建的嵌合基因对RNA介导抗病性的影响 | 第109页 |
| ·RNA 介导的病毒抗性与植物病毒的协生作用 | 第109-110页 |
| 4 结 论 | 第110-112页 |
| ·非翻译PVY~N-CP和 PVX-CP以不同片段长度和顺序连接组成嵌合基因转化烟草的抗病性研究 | 第110页 |
| ·PVY~N-CP 3′ 端基因片段和 PVX-CP 3′ 端基因片段组成嵌合基因构建 Hairpin 结构基因转化烟草的抗病性研究 | 第110-112页 |
| 5 参考文献 | 第112-127页 |
| 6 附 录 | 第127-142页 |
| ·附录 A:常用溶液、试剂、培养基的配制及仪器 | 第127-134页 |
| ·附录 B:本文所用载体图谱 | 第134-137页 |
| ·附录 C:转基因烟草的获得 | 第137-142页 |
| 7 致 谢 | 第142-143页 |
| 8 在读期间发表论文情况 | 第143页 |
