| 中文摘要 | 第1-3页 |
| ABSTRACT | 第3-9页 |
| 前 言 | 第9-10页 |
| 第一章 文献综述 | 第10-35页 |
| ·融合蛋白的位点特异性切割 | 第10-14页 |
| ·基因的融合和融合蛋白的表达 | 第10-11页 |
| ·纯化融合蛋白 | 第11-12页 |
| ·切割融合蛋白 | 第12-14页 |
| ·肠激酶的研究现状 | 第14-19页 |
| ·肠激酶的理化性质与生理功能 | 第14-15页 |
| ·牛肠激酶的氨基酸结构分析 | 第15-17页 |
| ·牛肠激酶催化亚基的基因工程研究 | 第17-19页 |
| ·肠激酶的活性测定方法 | 第19页 |
| ·白细胞介素-11(IL-11)的研究进展 | 第19-21页 |
| ·IL-11的发现、命名及基因克隆 | 第19-20页 |
| ·IL-11的基因结构与蛋白特性 | 第20-5416页 |
| ·IL-11的产生及生物学功能 | 第5416-20页 |
| ·IL-11的基因工程研究 | 第20-21页 |
| ·基因工程重组蛋白在大肠杆菌中的表达 | 第21-26页 |
| ·选择重组蛋白的定位 | 第21-22页 |
| ·选择表达系统 | 第22-23页 |
| ·选择克隆载体 | 第23页 |
| ·选择启动子 | 第23-25页 |
| ·优化密码子 | 第25-6721页 |
| ·优化培养条件 | 第6721-26页 |
| ·基因工程重组蛋白在酵母中的表达 | 第26-31页 |
| ·选择酵母载体系统 | 第26-27页 |
| ·选择酵母表达宿主 | 第27-29页 |
| ·构建多拷贝菌株 | 第29页 |
| ·高密度发酵培养酵母细胞 | 第29-30页 |
| ·应用酵母系统表达外源基因的研究现状 | 第30-31页 |
| ·亲和纯化 | 第31-33页 |
| ·亲和层析技术的产生与发展 | 第31页 |
| ·亲和吸附介质 | 第31-32页 |
| ·亲和纯化的操作方式 | 第32页 |
| ·固定化金属离子亲和层析 | 第32-33页 |
| ·本文主要研究内容: | 第33-35页 |
| 第二章 牛肠激酶催化亚基CDNA的克隆 | 第35-49页 |
| ·实验材料 | 第35-36页 |
| ·实验方法 | 第36-41页 |
| ·提取牛十二指肠总RNA并扩增牛EKL cDNA片段 | 第36-38页 |
| ·pGEM?-T Easy/EKL重组克隆质粒的构建 | 第38-41页 |
| ·实验结果与讨论 | 第41-48页 |
| ·牛十二指肠总RNA的提取 | 第41-42页 |
| ·EKL cDNA片段的PCR扩增及其酶切鉴定 | 第42页 |
| ·重组克隆载体pGEM?-T Easy/EKL的酶切鉴定(见图 | 第42-43页 |
| ·重组克隆载体pGEM?-T Easy/EKL的序列测定 | 第43-48页 |
| ·本章小结 | 第48-49页 |
| 第三章 REKL-(HIS)8在大肠杆菌中的表达与纯化 | 第49-81页 |
| ·实验材料 | 第49-50页 |
| ·实验方法 | 第50-60页 |
| ·pET39b/EKL-(His)8重组融合型表达质粒的构建 | 第50-54页 |
| ·rEKL-(His)8在E.coli BL21(DE3)及BL21(DE3)pLysS中的初步表达 | 第54页 |
| ·SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表达结果 | 第54-56页 |
| ·诱导表达条件的优化 | 第56-57页 |
| ·IMAC法亲和纯化融合蛋白DsbA-rEKL-(His) | 第57-59页 |
| ·表达产物的超滤浓缩与生物活性分析 | 第59-60页 |
| ·实验结果 | 第60-71页 |
| ·重组质粒pET39b/EKL-(His)8的酶切鉴定 | 第60页 |
| ·重组质粒pET39b/EKL-(His)8的序列测定 | 第60-64页 |
| ·基因工程菌的生长曲线测定 | 第64页 |
| ·诱导表达产物的SDS-PAGE鉴定 | 第64-65页 |
| ·样品的相对迁移率(Rf)及诱导表达产物的分子量(MW) | 第65-66页 |
| ·优化诱导表达条件 | 第66-867页 |
| ·IMAC法批次纯化融合蛋白DsbA-rEKL-(His) | 第867-70页 |
| ·融合蛋白浓度的测定 | 第70-71页 |
| ·纯化产物的自催化切割活性分析 | 第71页 |
| ·讨论 | 第71-79页 |
| ·本章小结 | 第79-81页 |
| 第四章 REKL在毕赤酵母中的表达与纯化 | 第81-108页 |
| ·实验材料 | 第81-83页 |
| ·实验方法 | 第83-93页 |
| ·PCR扩增EKL 编码序列 | 第83页 |
| ·重组克隆载体pUCm-T/EKL的构建 | 第83-84页 |
| ·酵母分泌型表达载体pPIC9/EKL的构建 | 第84-85页 |
| ·pPIC9/EKL转化毕赤酵母细胞 | 第85-88页 |
| ·重组酵母细胞的蛋白质表达 | 第88-89页 |
| ·酵母工程细胞的扩大培养 | 第89页 |
| ·表达产物的浓缩 | 第89-90页 |
| ·表达产物的亲合纯化 | 第90-91页 |
| ·表达产物的生物活性测定 | 第91-93页 |
| ·实验结果 | 第93-101页 |
| ·重组克隆载体pUCm-T/EKL的酶切鉴定与序列测定 | 第93-96页 |
| ·重组穿梭质粒pPIC9/EKL的鉴定 | 第96-97页 |
| ·酵母基因组DNA的提取与鉴定 | 第97-98页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE鉴定 | 第98页 |
| ·样品的相对迁移率(Rf)及分子量(MW) | 第98-100页 |
| ·表达效率的粗略测定 | 第100页 |
| ·STI亲和层析洗脱液的SDS-PAGE鉴定 | 第100页 |
| ·表达产物的产率与生物活性 | 第100-101页 |
| ·讨论 | 第101-107页 |
| ·本章小结 | 第107-108页 |
| 第五章 利用肠激酶加工融合蛋白的方法制备RHIL | 第108-136页 |
| ·实验材料 | 第108-110页 |
| ·实验方法 | 第110-117页 |
| ·pET32a/IL-11重组融合型表达质粒的构建 | 第110-112页 |
| ·rhIL-11融合蛋白在E.coli BL21(DE3)及BL21(DE3)pLysS中的 | 第112页 |
| ·10L发酵罐中rhIL-11基因工程菌的培养与诱导表达 | 第112-113页 |
| ·rhIL-11融合蛋白的纯化工艺研究 | 第113-115页 |
| ·Gradfrac系统扩大规模纯化肠激酶融合蛋白 | 第115-116页 |
| ·融合蛋白Trx-IL-11的裂解及单体rhIL-11的分离 | 第116-117页 |
| ·实验结果 | 第117-128页 |
| ·PCR扩增人白细胞介素-11基因 | 第117页 |
| ·重组融合表达质粒pET32a/IL-11的酶切鉴定与序列测定 | 第117-121页 |
| ·诱导表达产物IL-11融合蛋白的SDS-PAGE鉴定 | 第121页 |
| ·样品的相对迁移率(Rf)及诱导表达产物的分子量(MW) | 第121-122页 |
| ·重组融合蛋白表达效率的测定 | 第122页 |
| ·金属螯合亲和层析纯化Trx-IL | 第122-126页 |
| ·重组肠激酶的扩大规模纯化 | 第126-128页 |
| ·裂解融合蛋白Trx-IL | 第128页 |
| ·分离单体rhIL | 第128页 |
| ·讨论 | 第128-134页 |
| ·本章小结 | 第134-136页 |
| 第六章 结论与展望 | 第136-138页 |
| ·结论 | 第136-137页 |
| ·展望 | 第137-138页 |
| 参 考 文 献 | 第138-147页 |
