| 摘要 | 第1-10页 |
| Abstract | 第10-12页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-18页 |
| ·布鲁氏菌胞内寄生机制 | 第12-13页 |
| ·布鲁氏菌代谢与毒力关系 | 第13-14页 |
| ·布鲁氏菌糖代谢相关毒力基因 | 第14页 |
| ·布鲁氏菌毒力相关糖代谢途径 | 第14页 |
| ·布鲁氏菌糖代谢调节过程 | 第14-15页 |
| ·布鲁氏菌糖代谢关键酶—苹果酸脱氢酶 | 第15-18页 |
| 第二章 引言 | 第18-20页 |
| ·研究背景 | 第18页 |
| ·技术路线 | 第18-20页 |
| 第三章 MDH基因的克隆与表达 | 第20-28页 |
| ·实验材料 | 第20-22页 |
| ·实验方法 | 第22-24页 |
| ·载体构建 | 第22-23页 |
| ·牛型布鲁氏菌A19株基因组提取 | 第22页 |
| ·PCR引物设计 | 第22页 |
| ·MDH编码基因的扩增体系及条件 | 第22-23页 |
| ·PCR产物与克隆载体pMD18-T simple的连接 | 第23页 |
| ·重组质粒pET-28a-MDH的构建 | 第23页 |
| ·转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞 | 第23页 |
| ·重组质粒的提取及酶切、测序鉴定 | 第23页 |
| ·诱导表达与纯化 | 第23-24页 |
| ·苹果酸脱氢酶的诱导表达 | 第23-24页 |
| ·苹果酸脱氢酶的制备 | 第24页 |
| ·苹果酸脱氢酶的纯化 | 第24页 |
| ·结果与分析 | 第24-26页 |
| ·重组质粒pET-28a-MDH的构建及其结果 | 第24-25页 |
| ·布鲁氏菌苹果酸脱氢酶诱导表达及纯化结果 | 第25-26页 |
| ·讨论 | 第26-28页 |
| 第四章 生物信息学分析 | 第28-34页 |
| ·材料来源 | 第28页 |
| ·方法 | 第28页 |
| ·结果与分析 | 第28-31页 |
| ·蛋白质的理化性质 | 第28页 |
| ·蛋白质信号肽预测 | 第28-29页 |
| ·蛋白质跨膜区预测 | 第29页 |
| ·B细胞表位分析 | 第29-30页 |
| ·InterPro Scan分析 | 第30页 |
| ·MDH二级结构预测 | 第30-31页 |
| ·MDH三维结构预测 | 第31页 |
| ·讨论 | 第31-34页 |
| 第五章 酶学性质 | 第34-46页 |
| ·实验材料 | 第34页 |
| ·实验方法 | 第34-40页 |
| ·苹果酸脱氢酶酶学性质测定 | 第34-36页 |
| ·酶活测定原理 | 第34页 |
| ·最适pH测定 | 第34页 |
| ·最适温度测定 | 第34-35页 |
| ·热稳定性测定 | 第35页 |
| ·不同金属离子对酶活力的影响 | 第35页 |
| ·酶活测定方法 | 第35页 |
| ·酶活测定体系 | 第35页 |
| ·Km值及Vmax值测定 | 第35-36页 |
| ·酶活位点分析和重叠引物延伸PCR定点突变载体构建 | 第36-39页 |
| ·定点突变位点的确定 | 第36-37页 |
| ·突变引物设计 | 第37-38页 |
| ·定点突变采用技术一重叠引物延伸PCR原理 | 第38页 |
| ·重叠引物延伸PCR设计 | 第38-39页 |
| ·突变重组表达载体的构建 | 第39页 |
| ·突变重组载体诱导表达及其对酶活影响分析 | 第39-40页 |
| ·突变后苹果酸脱氢酶诱导表达及粗酶液制备纯化 | 第39页 |
| ·突变后苹果酸脱氢酶酶活比较 | 第39-40页 |
| ·实验结果 | 第40-44页 |
| ·苹果酸脱氢酶酶学性质 | 第40-42页 |
| ·最适pH值 | 第40页 |
| ·最适温度 | 第40-41页 |
| ·热稳定性 | 第41页 |
| ·不同金属离子对酶活力的影响 | 第41-42页 |
| ·酶活及比活力分析 | 第42页 |
| ·米氏常数Km值及Vmax值 | 第42页 |
| ·重叠引物延伸PCR结果分析 | 第42-43页 |
| ·突变重组载体诱导表达与纯化 | 第43-44页 |
| ·定点改造后苹果酸脱氢酶酶活比较 | 第44页 |
| ·讨论 | 第44-46页 |
| 第六章 免疫学特性 | 第46-52页 |
| ·实验材料 | 第46页 |
| ·实验方法 | 第46-47页 |
| ·MDH检测布鲁氏菌阳性牛血清 | 第46页 |
| ·MDH兔抗血清的制备及Western blot检测 | 第46-47页 |
| ·牛型布鲁氏菌A19全菌蛋白、膜蛋白及分泌蛋白的提取 | 第47页 |
| ·MDH亚细胞定位及纤连蛋白和纤连蛋白溶酶原的结合试验 | 第47页 |
| ·MDH兔抗血清对布鲁氏菌粘附与入侵Hela细胞的试验 | 第47页 |
| ·实验结果 | 第47-51页 |
| ·ELISA检测自然感染布鲁氏菌阳性牛血清 | 第47-48页 |
| ·MDH兔抗血清的制备及Western blot分析 | 第48页 |
| ·MDH亚细胞定位及FL、PL活性分析 | 第48-50页 |
| ·MDH兔抗血清对布鲁氏菌黏附与入侵Hela细胞的影响 | 第50-51页 |
| ·讨论 | 第51-52页 |
| 论文总结及创新点 | 第52-54页 |
| 参考文献 | 第54-58页 |
| 附录 | 第58-60页 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 | 第58页 |
| 攻读硕士学位期间参加课题 | 第58-60页 |
| 致谢 | 第60页 |
