| 摘要 | 第1-11页 |
| ABSTRACT | 第11-12页 |
| 英文缩写说明 | 第12-13页 |
| 第一章 前言 | 第13-20页 |
| ·醇脱氢酶研究概况 | 第13-14页 |
| ·醇脱氢酶概况 | 第13-14页 |
| ·醇脱氢酶的应用 | 第14页 |
| ·马肝醇脱氢酶研究概况 | 第14-19页 |
| ·马肝醇脱氢酶的性质 | 第14-15页 |
| ·马肝醇脱氢酶的氧化还原反应过程 | 第15页 |
| ·马肝醇脱氢酶的生物学功能 | 第15-17页 |
| ·研究意义及国内外现状分析 | 第17-19页 |
| ·立题依据 | 第19-20页 |
| 第二章 马肝醇脱氢酶基因在E.COLI中的克隆表达 | 第20-42页 |
| ·材料 | 第20-23页 |
| ·化学药品和生化试剂 | 第20-21页 |
| ·酶 | 第20页 |
| ·生化试剂 | 第20-21页 |
| ·培养基组分 | 第21页 |
| ·菌种和质粒 | 第21-22页 |
| ·菌种 | 第21-22页 |
| ·质粒 | 第22页 |
| ·培养基配方 | 第22页 |
| ·所用的缓冲液 | 第22-23页 |
| ·仪器设备 | 第23页 |
| ·试验方法 | 第23-29页 |
| ·菌种的培养和保藏 | 第24页 |
| ·碱变性法微量制备质粒 | 第24页 |
| ·E.coli质粒的纯化 | 第24页 |
| ·DNA片段凝胶回收(V-gene DNA Gel Extraction Kit) | 第24-25页 |
| ·质粒DNA的酶切 | 第25页 |
| ·质粒与外源片段的连接 | 第25页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl_2法) | 第25-26页 |
| ·大肠杆菌质粒的转化 | 第26页 |
| ·PCR扩增 | 第26页 |
| ·RT-PCR反应 | 第26-27页 |
| ·马肝总RNA的提取 | 第27页 |
| ·马肝醇脱氢酶基因亚克隆的构建 | 第27-28页 |
| ·马肝醇脱氢酶基因工程菌的构建 | 第28页 |
| ·诱导表达 | 第28页 |
| ·SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第28-29页 |
| ·对重组表达产物的初步活性测定 | 第29页 |
| ·结果与讨论 | 第29-40页 |
| ·马肝总RNA的抽提 | 第29页 |
| ·马肝醇脱氢酶基因的克隆 | 第29-31页 |
| ·马肝醇脱氢酶基因的测序 | 第31页 |
| ·马肝醇脱氢酶基因表达载体pLY105E/S的构建 | 第31-33页 |
| ·马肝醇脱氢酶基因工程菌pLY105E/S的诱导表达分析 | 第33-34页 |
| ·其它引物的设计 | 第34-35页 |
| ·马肝醇脱氢酶基因工程菌pLY107E/S、pLY108E/S、pLY109E/S、pLY110E/S和pLY115E/S的构建 | 第35-38页 |
| ·马肝醇脱氢酶基因工程菌pLY107E/S的构建 | 第35页 |
| ·马肝醇脱氢酶基因工程菌pLY108E/S的构建 | 第35-37页 |
| ·马肝醇脱氢酶基因工程菌pLY109E/S、pLY110E/S的构建 | 第37页 |
| ·马肝醇脱氢酶基因工程菌pLY115E/S的构建 | 第37-38页 |
| ·马肝醇脱氢酶基因工程菌pLY107E/S、pLY108E/S、pLY109E/S、pLY110E/S和pLY115E/S的诱导表达 | 第38-40页 |
| ·结论 | 第40-41页 |
| ·讨论 | 第41-42页 |
| 第三章 重组马肝醇脱氢酶活性研究 | 第42-50页 |
| ·材料 | 第42-43页 |
| ·试剂 | 第42页 |
| ·溶液配制 | 第42-43页 |
| ·仪器设备 | 第43页 |
| ·方法 | 第43-46页 |
| ·培养菌体 | 第43页 |
| ·破碎菌体制备 | 第43页 |
| ·酶催化反应的进行 | 第43页 |
| ·重组马肝醇脱氢酶的亲和纯化 | 第43-44页 |
| ·粗酶液制备 | 第44页 |
| ·亲和层析 | 第44页 |
| ·BCA法测定蛋白质浓度 | 第44页 |
| ·NADH标准曲线的绘制及马肝醇脱氢酶活力的测定 | 第44-45页 |
| ·NADH标准曲线的绘制 | 第44-45页 |
| ·马肝醇脱氢酶活力的测定方法 | 第45页 |
| ·温度对马肝醇脱氢酶活力的影响 | 第45页 |
| ·pH对马肝醇脱氢酶活力的影响 | 第45页 |
| ·金属离子和EDTA对马肝醇脱氢酶活力的影响 | 第45页 |
| ·米氏常数的测定 | 第45-46页 |
| ·结果 | 第46-49页 |
| ·重组马肝醇脱氢酶纯化结果 | 第46页 |
| ·BCA法测定蛋白质浓度结果 | 第46-47页 |
| ·NADH标准曲线的绘制 | 第47页 |
| ·温度对马肝醇脱氢酶活力的影响 | 第47页 |
| ·pH对马肝醇脱氢酶活力的影响 | 第47-48页 |
| ·金属离子对马肝醇脱氢酶活力的影响 | 第48页 |
| ·米氏常数的测定 | 第48-49页 |
| ·结论 | 第49-50页 |
| 第四章 在毕赤酵母中表达马肝醇脱氢酶的初步研究 | 第50-64页 |
| ·材料 | 第50-52页 |
| ·菌种和质粒 | 第50页 |
| ·菌种 | 第50页 |
| ·质粒 | 第50页 |
| ·试剂 | 第50-51页 |
| ·生化试剂 | 第50-51页 |
| ·培养基成分 | 第51页 |
| ·培养基 | 第51-52页 |
| ·培养基原液 | 第51页 |
| ·培养基 | 第51-52页 |
| ·所用溶液及缓冲液 | 第52页 |
| ·主要的实验仪器 | 第52页 |
| ·实验方法 | 第52-57页 |
| ·酵母菌株的保存 | 第52-53页 |
| ·酵母菌株的分离纯化 | 第53页 |
| ·毕赤酵母表达系统的实验方法 | 第53-57页 |
| ·线性化质粒DNA的脱磷酸化处理 | 第53页 |
| ·酵母电转化感受态细胞的制备 | 第53-54页 |
| ·电击转化 | 第54页 |
| ·Mut+型和Muts型转化子的筛选 | 第54页 |
| ·直接用菌落PCR方法鉴定转化子 | 第54-55页 |
| ·毕赤酵母总DNA提取方法 | 第55-56页 |
| ·用毕赤酵母总DNA进行PCR检测 | 第56页 |
| ·Mut+型重组酵母的诱导表达 | 第56-57页 |
| ·结果 | 第57-62页 |
| ·表达质粒的构建和鉴定 | 第57-60页 |
| ·电击转化 | 第60页 |
| ·阳性克隆的筛选和鉴定 | 第60-62页 |
| ·pLY106E和pLY106S的PCR扩增结果 | 第60-61页 |
| ·pLY106E和pLY106S的PCR扩增结分析 | 第61-62页 |
| ·阳性克隆在毕赤酵母中表达 | 第62页 |
| ·结论 | 第62页 |
| ·讨论 | 第62-64页 |
| 第五章 全文总结 | 第64-65页 |
| 参考文献 | 第65-68页 |
| 附录1 PCR产物测序结果 | 第68-72页 |
| 致谢 | 第72-73页 |
| 个人简历 | 第73页 |
