| 摘要 | 第3-6页 |
| abstract | 第6-9页 |
| 中英文缩略词表 | 第13-14页 |
| 第1章 引言 | 第14-17页 |
| 第2章 蛇PLIγ改组及噬菌体文库的构建 | 第17-28页 |
| 2.1 实验器材 | 第17-19页 |
| 2.1.1 载体、菌株 | 第17-18页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第18页 |
| 2.1.3 主要仪器与设备 | 第18页 |
| 2.1.4 主要溶液的制备 | 第18-19页 |
| 2.2 实验方法 | 第19-25页 |
| 2.2.1 蛇肝脏总RNA的提取 | 第19页 |
| 2.2.2 cDNA的合成 | 第19-20页 |
| 2.2.3 PCR扩增亲本PLIγ基因 | 第20-21页 |
| 2.2.4 DNAShuffling | 第21-22页 |
| 2.2.5 噬菌粒载体pCANTAB5e的制备 | 第22-23页 |
| 2.2.6 改组PLIγ文库的构建 | 第23-25页 |
| 2.3 结果 | 第25-27页 |
| 2.3.1 亲本PLIγ基因克隆 | 第25页 |
| 2.3.2 DNA改组 | 第25-26页 |
| 2.3.3 pCANTAB5e-cPLIγ重组载体验证 | 第26-27页 |
| 2.4 讨论 | 第27-28页 |
| 第3章 cPLIγ淘筛及pET28c-cPLIγ的构建 | 第28-38页 |
| 3.1 实验材料 | 第28-30页 |
| 3.1.1 载体、菌株 | 第28页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第28-29页 |
| 3.1.3 主要仪器及设备 | 第29页 |
| 3.1.4 主要试剂配制 | 第29-30页 |
| 3.2 实验方法 | 第30-34页 |
| 3.2.1 辅助噬菌体毒种制备 | 第30页 |
| 3.2.2 辅助噬菌体毒种的滴定 | 第30页 |
| 3.2.3 包被蛇毒 | 第30-31页 |
| 3.2.4 构建噬菌体库 | 第31页 |
| 3.2.5 淘筛 | 第31-32页 |
| 3.2.6 构建pET28c-PLIγ重组质粒 | 第32-34页 |
| 3.2.7 连接产物的转化及鉴定 | 第34页 |
| 3.3 结果 | 第34-36页 |
| 3.3.1 淘筛结果 | 第34-35页 |
| 3.3.2 pET28c-cPLIγ的PCR和酶切验证 | 第35-36页 |
| 3.3.3 王锦蛇PLIγ重组表达载体的验证 | 第36页 |
| 3.4 讨论 | 第36-38页 |
| 第4章 改组PLIγ的可溶性表达及活性验证 | 第38-55页 |
| 4.1 实验器材 | 第38-40页 |
| 4.1.1 主要试剂 | 第38页 |
| 4.1.2 实验动物 | 第38页 |
| 4.1.3 主要仪器与设备 | 第38-39页 |
| 4.1.4 溶液的配制 | 第39-40页 |
| 4.2 实验方法 | 第40-46页 |
| 4.2.1 重组质粒转化至大肠杆菌 BL21 | 第40-41页 |
| 4.2.2 诱导表达 | 第41-42页 |
| 4.2.3 PLIγ融合蛋白可溶性表达 | 第42-43页 |
| 4.2.4 优化诱导表达条件 | 第43-44页 |
| 4.2.5 Ni-NTA亲和层析 | 第44页 |
| 4.2.6 蛋白浓缩 | 第44-45页 |
| 4.2.7 BSA蛋白定量 | 第45页 |
| 4.2.8 PLIγ抗出血毒活性 | 第45-46页 |
| 4.2.9 PLIγ序列分析 | 第46页 |
| 4.3 结果 | 第46-52页 |
| 4.3.1 cPLIγs蛋白的表达 | 第46页 |
| 4.3.2 PLIγs重组蛋白的可溶性分析 | 第46-47页 |
| 4.3.3 诱导温度和时间的优化 | 第47-48页 |
| 4.3.4 目的蛋白的分离纯化 | 第48-49页 |
| 4.3.5 BCA蛋白定量 | 第49页 |
| 4.3.6 cPLIγ抗出血毒活性 | 第49-51页 |
| 4.3.7 序列分析 | 第51-52页 |
| 4.4 讨论与总结 | 第52-55页 |
| 第5章 结论与展望 | 第55-56页 |
| 5.1 结论 | 第55页 |
| 5.2 进一步工作方向 | 第55-56页 |
| 致谢 | 第56-57页 |
| 参考文献 | 第57-62页 |
| 攻读学位期间的研究成果 | 第62-63页 |
| 综述 | 第63-74页 |
| 参考文献 | 第71-74页 |
