| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 符号、变量、缩略词 | 第7-8页 |
| 目录 | 第8-13页 |
| 第一章 绪论 | 第13-31页 |
| 1.1 木聚糖及其降解酶系 | 第13-14页 |
| 1.2 木聚糖酶 | 第14-16页 |
| 1.2.1 木聚糖酶的定义 | 第14页 |
| 1.2.2 木聚糖酶的分类 | 第14-15页 |
| 1.2.3 木聚糖酶的结构域 | 第15-16页 |
| 1.3 木聚糖酶的克隆、表达及酶学特性分析 | 第16-22页 |
| 1.3.1 木聚糖酶基因的克隆及分析 | 第16-17页 |
| 1.3.2 木聚糖酶的异源表达 | 第17页 |
| 1.3.3 木聚糖酶的酶学性质 | 第17-19页 |
| 1.3.4 木聚糖酶的空间结构 | 第19-21页 |
| 1.3.5 木聚糖酶的催化机制 | 第21-22页 |
| 1.4 木聚糖酶的应用 | 第22-24页 |
| 1.4.1 饲料工业 | 第22-23页 |
| 1.4.2 造纸工业 | 第23页 |
| 1.4.3 低聚木糖的生产 | 第23页 |
| 1.4.4 能源工业 | 第23-24页 |
| 1.4.5 其它工业 | 第24页 |
| 1.4.6 木聚糖酶工业应用的限制 | 第24页 |
| 1.5 木聚糖酶热稳定性的研究进展 | 第24-29页 |
| 1.5.1 影响木聚糖酶热稳定性的因素 | 第24-27页 |
| 1.5.2 GH 10 家族木聚糖酶热稳定性的分子改造 | 第27-29页 |
| 1.6 论文的立题依据及主要研究内容 | 第29-31页 |
| 1.6.1 立题依据和研究意义 | 第29页 |
| 1.6.2 论文的主要研究内容 | 第29-31页 |
| 第二章 木聚糖酶基因 Ausxyn10A 的克隆及序列分析 | 第31-45页 |
| 2.1 引言 | 第31页 |
| 2.2 材料与方法 | 第31-37页 |
| 2.2.1 菌株和试剂盒 | 第31页 |
| 2.2.2 培养基及相关试剂 | 第31页 |
| 2.2.3 引物设计及合成 | 第31-32页 |
| 2.2.4 RNA 及基因组 DNA 的提取 | 第32页 |
| 2.2.5 Ausxyn10A cDNA 序列的克隆 | 第32-34页 |
| 2.2.6 Ausxyn10A DNA 序列的克隆 | 第34-36页 |
| 2.2.7 重组克隆质粒的构建、转化及鉴定 | 第36-37页 |
| 2.2.8 AusXyn10A 基因序列及其推测氨基酸序列的分析 | 第37页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第37-43页 |
| 2.3.1 Ausxyn10A 完整 cDNA 序列的克隆 | 第37-38页 |
| 2.3.2 Ausxyn10A DNA 序列的克隆 | 第38-39页 |
| 2.3.3 Ausxyn10A 基因序列的分析 | 第39页 |
| 2.3.4 AusXyn10A 氨基酸序列的分析 | 第39-43页 |
| 2.3.5 Ausxyn10A 与 GH 11 家族木聚糖酶 XynI 序列的比对分析 | 第43页 |
| 2.4 本章小结 | 第43-45页 |
| 第三章 木聚糖酶基因 Ausxyn10A 在 P.pastoris 中的表达 | 第45-66页 |
| 3.1 引言 | 第45页 |
| 3.2 材料与方法 | 第45-51页 |
| 3.2.1 菌种和试剂 | 第45-46页 |
| 3.2.2 主要溶液与培养基配制 | 第46页 |
| 3.2.3 引物的设计与合成 | 第46页 |
| 3.2.4 天然 N 端表达质粒 pPIC9KM的构建 | 第46-47页 |
| 3.2.5 成熟肽基因的克隆及重组表达质粒的构建 | 第47-48页 |
| 3.2.6 重组毕赤酵母的构建、筛选与表达 | 第48-49页 |
| 3.2.7 表达产物的分析 | 第49页 |
| 3.2.8 重组子的发酵条件优化 | 第49-50页 |
| 3.2.9 重组木聚糖酶的分离纯化 | 第50页 |
| 3.2.10 酶学性质测定 | 第50-51页 |
| 3.2.11 AusXyn10A 水解条件优化 | 第51页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第51-65页 |
| 3.3.1 pPIC9KM质粒的构建 | 第51-54页 |
| 3.3.2 成熟肽基因 Ausxyn10A 的克隆 | 第54-55页 |
| 3.3.3 pPIC9KM-Ausxyn10A 的构建 | 第55页 |
| 3.3.4 GS115/Ausxyn10A 的构建、筛选及表达 | 第55-56页 |
| 3.3.5 GS115/Ausxyn10A 诱导表达条件优化 | 第56-59页 |
| 3.3.6 reAusXyn10A 的分离纯化 | 第59-61页 |
| 3.3.7 reAusXyn10A 酶学性质的分析 | 第61-62页 |
| 3.3.8 玉米芯木聚糖的酶解条件优化 | 第62-65页 |
| 3.4 本章小结 | 第65-66页 |
| 第四章 N/C 端片段替换对木聚糖酶 AusXyn10A 热稳定性的影响 | 第66-87页 |
| 4.1 引言 | 第66-67页 |
| 4.2 材料与方法 | 第67-71页 |
| 4.2.1 菌种和试剂 | 第67页 |
| 4.2.2 主要溶液与培养基配制 | 第67页 |
| 4.2.3 相关分析软件 | 第67页 |
| 4.2.4 耐热木聚糖酶查找 | 第67页 |
| 4.2.5 同源建模与分子动力学模拟 | 第67页 |
| 4.2.6 C 端片段替换杂合酶 AusXynCRC1 基因的构建 | 第67-68页 |
| 4.2.7 C 端片段替换杂合酶 AusXynCRC2 基因的构建 | 第68-69页 |
| 4.2.8 N 端片段替换杂合酶 AusXynCRN1 基因的构建 | 第69-70页 |
| 4.2.9 N 端片段替换杂合酶 AusXynCRN2 基因的构建 | 第70页 |
| 4.2.10 重组表达质粒的构建 | 第70页 |
| 4.2.11 毕赤酵母重组子的构建、筛选及表达 | 第70页 |
| 4.2.12 表达产物的鉴定与分析 | 第70-71页 |
| 4.2.13 重组酶的分离纯化 | 第71页 |
| 4.2.14 酶学性质测定 | 第71页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第71-84页 |
| 4.3.1 C 端片段替换 | 第71-72页 |
| 4.3.2 N 端片段替换 | 第72-75页 |
| 4.3.3 杂合酶基因的构建 | 第75-77页 |
| 4.3.4 重组表达质粒的构建 | 第77-78页 |
| 4.3.5 毕赤酵母重组子的构建、筛选及表达 | 第78-79页 |
| 4.3.6 重组木聚糖酶的分离纯化 | 第79-80页 |
| 4.3.7 酶学性质的分析 | 第80-83页 |
| 4.3.8 热稳定性变化的机理解析 | 第83-84页 |
| 4.4 本章小结 | 第84-87页 |
| 第五章 二硫键的添加对木聚糖酶 AusXyn10A 热稳定性的影响 | 第87-98页 |
| 5.1 引言 | 第87页 |
| 5.2 材料与方法 | 第87-90页 |
| 5.2.1 菌种和试剂 | 第87页 |
| 5.2.2 主要溶液与培养基配制 | 第87-88页 |
| 5.2.3 相关分析软件 | 第88页 |
| 5.2.4 AusXyn10A 中二硫键的理性引入 | 第88页 |
| 5.2.5 引物设计 | 第88页 |
| 5.2.6 突变酶 D7C/G42C 基因的构建 | 第88-89页 |
| 5.2.7 突变酶 S246C/A297C 基因的构建 | 第89页 |
| 5.2.8 重组表达质粒的构建 | 第89-90页 |
| 5.2.9 毕赤酵母重组子的构建、筛选及表达 | 第90页 |
| 5.2.10 表达产物的鉴定与分析 | 第90页 |
| 5.2.11 重组酶的分离纯化 | 第90页 |
| 5.2.12 酶学性质测定 | 第90页 |
| 5.2.13 游离半胱氨酸测定 | 第90页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第90-97页 |
| 5.3.1 二硫键的设计 | 第90-91页 |
| 5.3.2 突变酶 D7C/G42C 基因的构建 | 第91-92页 |
| 5.3.3 突变酶 S246C/A297C 基因的构建 | 第92-93页 |
| 5.3.4 重组表达质粒的构建 | 第93页 |
| 5.3.5 毕赤酵母重组子的构建、筛选及表达 | 第93-94页 |
| 5.3.6 重组木聚糖酶的分离纯化 | 第94-95页 |
| 5.3.7 酶学性质的分析 | 第95-97页 |
| 5.4 本章小结 | 第97-98页 |
| 第六章 木聚糖酶 AusXyn10A 热稳定性的半理性设计 | 第98-119页 |
| 6.1 引言 | 第98页 |
| 6.2 材料与方法 | 第98-103页 |
| 6.2.1 菌种和试剂 | 第98页 |
| 6.2.2 主要溶液与培养基配制 | 第98页 |
| 6.2.3 相关分析软件 | 第98-99页 |
| 6.2.4 AusXyn10A 在大肠杆菌中的表达 | 第99-100页 |
| 6.2.5 分子动力学模拟及 B-factor 值计算 | 第100页 |
| 6.2.6 拟突变位点的分析与选择 | 第100页 |
| 6.2.7 突变酶基因的构建 | 第100-102页 |
| 6.2.8 重组表达质粒的构建 | 第102页 |
| 6.2.9 表达产物的鉴定与分析 | 第102-103页 |
| 6.2.10 酶学性质测定 | 第103页 |
| 6.2.11 同源建模及三维结构比对 | 第103页 |
| 6.2.12 耐热突变子的组合 | 第103页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第103-117页 |
| 6.3.1 AusXyn10A 在大肠杆菌中的表达及酶学性质分析 | 第103-106页 |
| 6.3.2 B-factor 值计算结果分析及拟突变位点的选择 | 第106-108页 |
| 6.3.3 突变基因的构建及转化 | 第108-109页 |
| 6.3.4 重组子表达及筛选 | 第109页 |
| 6.3.5 S278 突变子的筛选及热稳定性分析 | 第109-111页 |
| 6.3.6 S280 突变子的筛选及热稳定性分析 | 第111-113页 |
| 6.3.7 R59 突变子的筛选及热稳定性分析 | 第113-114页 |
| 6.3.8 突变酶的热稳定性变化机理分析 | 第114-116页 |
| 6.3.9 耐热突变子的组合 | 第116-117页 |
| 6.4 本章小结 | 第117-119页 |
| 主要结论与展望 | 第119-122页 |
| 主要结论 | 第119-121页 |
| 展望 | 第121-122页 |
| 论文主要创新点 | 第122-123页 |
| 致谢 | 第123-124页 |
| 参考文献 | 第124-132页 |
| 附录: 作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第132页 |
