| 摘要 | 第6-8页 |
| ABSTRACT | 第8-10页 |
| 文献综述 | 第15-47页 |
| 第一章 肠上皮细胞与细胞永生化 | 第15-24页 |
| 1.1 肠上皮细胞与免疫 | 第15-19页 |
| 1.1.1 小肠上皮与疾病发生 | 第15-16页 |
| 1.1.2 上皮细胞影响肠道免疫细胞 | 第16页 |
| 1.1.3 肠上皮细胞引发肠道内的免疫耐受 | 第16-17页 |
| 1.1.4 免疫细胞影响肠道上皮细胞 | 第17-18页 |
| 1.1.5 肠上皮细胞的调控与炎症发生 | 第18-19页 |
| 1.2 端粒酶活化与细胞永生化 | 第19-24页 |
| 1.2.1 细胞衰老和端粒损伤 | 第20-21页 |
| 1.2.2 端粒酶与衰老 | 第21页 |
| 1.2.3 端粒酶活性与抗衰老 | 第21-24页 |
| 第二章 轮状病毒研究进展 | 第24-47页 |
| 2.1 轮状病毒的基因组结构及生物学特性 | 第24-30页 |
| 2.1.1 轮状病毒的基因组结构 | 第24-25页 |
| 2.1.2 轮状病毒的分类 | 第25页 |
| 2.1.3 轮状病毒的复制周期 | 第25-30页 |
| 2.2 轮状病毒的致病机制 | 第30-32页 |
| 2.3 NSP4 蛋白在轮状病毒复制和致病中的作用 | 第32-37页 |
| 2.3.1 NSP4 的结构和膜拓扑学 | 第33-34页 |
| 2.3.2 NSP4 受体活性 | 第34-35页 |
| 2.3.3 NSP4 与胞内钙离子（Ca2+）内稳态 | 第35-36页 |
| 2.3.4 NSP4 与细胞蛋白的相互作用 | 第36页 |
| 2.3.5 NSP4 作为肠毒素的释放 | 第36-37页 |
| 2.4 Viroporin 的结构及生物学特性 | 第37-47页 |
| 2.4.1 Viroporin 的结构分类 | 第38-39页 |
| 2.4.2 Viroporin 的细胞病变效应 | 第39-40页 |
| 2.4.3 膜重塑及糖蛋白的运输 | 第40-41页 |
| 2.4.4 Viroporin 与病毒生命周期 | 第41-42页 |
| 2.4.5 Viroporin 的孔形成活性 | 第42-47页 |
| 试验研究 | 第47-107页 |
| 第三章 永生化猪小肠上皮细胞系的建立 | 第47-68页 |
| 3.1 材料 | 第47-48页 |
| 3.1.1 细胞、菌株与质粒 | 第47页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第47-48页 |
| 3.1.3 主要仪器与设备 | 第48页 |
| 3.2 方法 | 第48-53页 |
| 3.2.1 细胞培养液配方 | 第48页 |
| 3.2.2 pCI-neo-hTERT 质粒的转化与鉴定 | 第48-49页 |
| 3.2.3 pCI-neo-hTERT 质粒转染猪小肠上皮细胞 | 第49页 |
| 3.2.4 转染细胞鉴定 | 第49-50页 |
| 3.2.5 转染细胞生长特性的检测 | 第50-51页 |
| 3.2.6 RT-PCR 检测转染细胞中外源性 hTERT 基因的表达 | 第51-52页 |
| 3.2.7 细胞的转化特征鉴定 | 第52页 |
| 3.2.8 HE 染色 | 第52页 |
| 3.2.9 转染细胞端粒酶活性检测 | 第52-53页 |
| 3.3 结果 | 第53-64页 |
| 3.3.1 pCI-neo-hTERT 测序鉴定 | 第53页 |
| 3.3.2 猪小肠上皮细胞最佳 G418 筛选浓度确定 | 第53-54页 |
| 3.3.3 转染后阳性克隆的获得 | 第54页 |
| 3.3.4 形态学鉴定 | 第54-57页 |
| 3.3.5 SIEC02 细胞的肠上皮特征鉴定 | 第57-59页 |
| 3.3.6 生长曲线和细胞周期与凋亡 | 第59-60页 |
| 3.3.7 转染后细胞的 hTERT 基因的 RT-PCR 检测 | 第60页 |
| 3.3.8 端粒酶活性检测 | 第60-61页 |
| 3.3.9 SIEC02 细胞转化能力分析 | 第61-62页 |
| 3.3.10 接触抑制性 | 第62-64页 |
| 3.3.11 细胞增殖分析 | 第64页 |
| 3.4 讨论 | 第64-67页 |
| 3.5 小结 | 第67-68页 |
| 第四章 永生化猪小肠上皮细胞的生物学特性研究 | 第68-81页 |
| 4.1 材料 | 第68页 |
| 4.1.1 主要试剂和细菌 | 第68页 |
| 4.1.2 主要仪器设备 | 第68页 |
| 4.2 方法 | 第68-72页 |
| 4.2.1 细菌侵染 | 第68-69页 |
| 4.2.2 细菌黏附 | 第69页 |
| 4.2.3 免疫刺激 | 第69-70页 |
| 4.2.4 实时荧光定量 PCR 检测免疫相关基因 | 第70-72页 |
| 4.3 结果 | 第72-77页 |
| 4.3.1 细菌对永生化猪小肠上皮细胞的黏附试验 | 第72-73页 |
| 4.3.2 细菌侵染效率检测 | 第73-75页 |
| 4.3.3 SIEC02 细胞对沙门菌感染与 LPS 刺激产生免疫应答的检测 | 第75页 |
| 4.3.4 血清对 SIEC02 细胞的影响 | 第75-77页 |
| 4.4 讨论 | 第77-79页 |
| 4.5 小结 | 第79-81页 |
| 第五章 猪轮状病毒对永生化猪小肠上皮细胞的影响 | 第81-94页 |
| 5.1 材料 | 第81-82页 |
| 5.1.1 细胞及其培养条件 | 第81-82页 |
| 5.1.2 病毒 | 第82页 |
| 5.1.3 主要试剂 | 第82页 |
| 5.1.4 主要仪器 | 第82页 |
| 5.2 方法 | 第82-84页 |
| 5.2.1 细胞培养 | 第82页 |
| 5.2.2 病毒复壮与增殖 | 第82页 |
| 5.2.3 猪轮状病毒感染 SIEC02 细胞 | 第82-83页 |
| 5.2.4 细胞活力检测 | 第83页 |
| 5.2.5 猪轮状病毒致细胞病变作用的检测 | 第83页 |
| 5.2.6 直接免疫荧光检测病毒蛋白的表达 | 第83页 |
| 5.2.7 Hochest 33258 染色检测 | 第83页 |
| 5.2.8 ELISA 检测细胞凋亡 | 第83页 |
| 5.2.9 TUNEL 检测早期细胞凋亡 | 第83-84页 |
| 5.2.10 透射电镜检测 | 第84页 |
| 5.2.11 流式细胞仪检测凋亡 | 第84页 |
| 5.2.12 线粒体膜电位检测 | 第84页 |
| 5.3 结果 | 第84-92页 |
| 5.3.1 猪轮状病毒对 SIEC02 活力影响 | 第84-86页 |
| 5.3.2 猪轮状病毒诱导 SIEC02 细胞发生细胞病变 | 第86-87页 |
| 5.3.3 流式细胞仪检测病毒蛋白的表达 | 第87页 |
| 5.3.4 透射电镜结果 | 第87-88页 |
| 5.3.5 猪轮状病毒诱导的凋亡 | 第88-92页 |
| 5.4 讨论 | 第92-93页 |
| 5.5 小结 | 第93-94页 |
| 第六章 猪轮状病毒 NSP4 蛋白的亚细定位及对猪小肠上皮细胞凋亡的影响 | 第94-107页 |
| 6.1 材料 | 第94-95页 |
| 6.1.1 材料 | 第94页 |
| 6.1.2 试剂和抗体 | 第94页 |
| 6.1.3 主要仪器 | 第94-95页 |
| 6.2 方法 | 第95-97页 |
| 6.2.1 细胞的培养 | 第95页 |
| 6.2.2 病毒增殖和感染 | 第95页 |
| 6.2.3 引物设计 | 第95页 |
| 6.2.4 基于 NSP4 基因相关 DNA 片段的载体构建 | 第95-96页 |
| 6.2.5 重组质粒转染 SIEC02 细胞 | 第96页 |
| 6.2.6 内质网定位载体 pDsred-ER 单克隆细胞的构建 | 第96页 |
| 6.2.7 亚细胞定位 | 第96页 |
| 6.2.8 Western blot 分析 | 第96页 |
| 6.2.9 Real-time PCR | 第96-97页 |
| 6.3 结果 | 第97-104页 |
| 6.3.1 PCR 扩增及重组质粒鉴定结果 | 第97-98页 |
| 6.3.2 猪轮状病毒 NSP4 viroporin 蛋白及其两翼结构亚细胞共定位 | 第98-103页 |
| 6.3.3 NSP4 蛋白及其 viroporin 对 caspase-3、Bax 和 Bcl-2 蛋白表达水平影响 | 第103页 |
| 6.3.4 NSP4 蛋白及其 viroporin 对 caspase-8 和 caspase-9 蛋白水平影响 | 第103-104页 |
| 6.3.5 NSP4 蛋白及其 viroporin 对 Bax 和 Bcl-2 转录表达水平影响 | 第104页 |
| 6.4 讨论 | 第104-106页 |
| 6.5 小结 | 第106-107页 |
| 结论 | 第107-108页 |
| 参考文献 | 第108-136页 |
| 附录 | 第136-141页 |
| 缩略词 | 第141-143页 |
| 致谢 | 第143-145页 |
| 个人简介 | 第145页 |
