| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4页 |
| 第1章 绪论 | 第8-13页 |
| 1.1 羧肽酶B简介 | 第8页 |
| 1.2 羧肽酶B的结构 | 第8-9页 |
| 1.3 结构与功能的关系 | 第9-10页 |
| 1.3.1 羧肽酶B活化 | 第9-10页 |
| 1.3.2 羧肽酶B的催化特性 | 第10页 |
| 1.4 羧肽酶B的应用 | 第10-11页 |
| 1.5 羧肽酶B的研究进展 | 第11页 |
| 1.6 模式生物粟酒裂殖酵母 | 第11-12页 |
| 1.7 本课题研究的目的、意义及主要内容 | 第12-13页 |
| 1.7.1 研究的意义和目的 | 第12页 |
| 1.7.2 研究的主要内容 | 第12-13页 |
| 第2章 人源羧肽酶B在大肠杆菌中表达研究 | 第13-24页 |
| 2.1 材料 | 第13-15页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第13页 |
| 2.1.2 培养基 | 第13-14页 |
| 2.1.3 培养条件 | 第14页 |
| 2.1.4 主要试剂及其来源 | 第14-15页 |
| 2.1.5 主要设备及其来源 | 第15页 |
| 2.2 方法 | 第15-21页 |
| 2.2.1 感受态细胞的制备 | 第15-16页 |
| 2.2.2 电转化 | 第16页 |
| 2.2.3 DNA酶切反应、磷酸化反应、连接反应及核酸浓缩 | 第16页 |
| 2.2.4 质粒的提取 | 第16页 |
| 2.2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第16-17页 |
| 2.2.6 人源CPB1基因cDNA克隆 | 第17-21页 |
| 2.2.6.1 引物设计 | 第17-18页 |
| 2.2.6.2 目的基因CPB1的扩增 | 第18页 |
| 2.2.6.3 重组表达质粒pHsh-CPB1的构建 | 第18页 |
| 2.2.6.4 重组菌的培养及重组酶的诱导表达 | 第18页 |
| 2.2.6.5 重组表达质粒pHsh-B5K-CPB1的构建 | 第18-19页 |
| 2.2.6.6 重组表达质粒pHsh-DT-CPB1的构建 | 第19页 |
| 2.2.6.7 羧肽酶B浓度的测定 | 第19-20页 |
| 2.2.6.8 羧肽酶B的测活方法 | 第20-21页 |
| 2.3 结果与分析 | 第21-22页 |
| 2.3.1 羧肽酶B基因CPB1的克隆 | 第21页 |
| 2.3.2 表达载体pHsh-CPB1的构建 | 第21-22页 |
| 2.3.3 表达载体pHsh-B5K-CPB1的构建 | 第22页 |
| 2.3.4 表达载体pHsh-DT-CPB1的构建 | 第22页 |
| 2.3.5 SDS-PAGE胶检测与酶活测定 | 第22页 |
| 2.4 讨论 | 第22-24页 |
| 第3章 利用粟酒裂殖酵母分泌表达羧肽酶B | 第24-34页 |
| 3.1 材料 | 第24-28页 |
| 3.1.1 菌株与质粒 | 第24-25页 |
| 3.1.2 培养基 | 第25-27页 |
| 3.1.3 培养条件 | 第27页 |
| 3.1.4 主要试剂及其来源 | 第27-28页 |
| 3.1.5 主要设备及其来源 | 第28页 |
| 3.2 方法 | 第28-31页 |
| 3.2.1 一般基因操作方法 | 第28页 |
| 3.2.2 裂殖酵母感受态细胞的制备和醋酸锂转化 | 第28-30页 |
| 3.2.2.1 转化中所用各种溶液的配制 | 第28-29页 |
| 3.2.2.2 鲑鱼精担体DNA的制备 | 第29页 |
| 3.2.2.3 感受态细胞的制备及醋酸锂转化 | 第29-30页 |
| 3.2.3 分泌型表达质粒peno-GFAT-cpy-CPB1的构建 | 第30页 |
| 3.2.4 peno-GFAT-cpy-CPB1质粒的转化与表达 | 第30-31页 |
| 3.2.5 羧肽酶B提取与酶活测定 | 第31页 |
| 3.2.6 羧肽酶B表达的SDS-PAGE | 第31页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第31-33页 |
| 3.3.1 质粒peno-GFAT-cpy-CPB1的构建 | 第31-32页 |
| 3.3.2 羧肽酶B的SDS-PAGE检测及酶活检测 | 第32-33页 |
| 3.4 讨论 | 第33-34页 |
| 第4章 构建ips6基因缺陷型粟酒裂殖酵母表达宿主 | 第34-51页 |
| 4.1 粟酒裂殖酵母 | 第34-35页 |
| 4.2 基因缺陷型表达载体介绍 | 第35页 |
| 4.3 敲除粟酒裂殖酵母中ISP6基因 | 第35-38页 |
| 4.4 实验材料 | 第38-42页 |
| 4.4.1 菌种和质粒 | 第38页 |
| 4.4.2 主要试剂和耗材 | 第38-39页 |
| 4.4.3 主要设备及其来源 | 第39-40页 |
| 4.4.4 培养基及各种贮备液 | 第40-42页 |
| 4.4.5 培养条件 | 第42页 |
| 4.5 实验方法 | 第42-48页 |
| 4.5.1 提取粟酒裂殖酵母(S.pombe YHL6381)的gfaA基因营养缺陷型菌株基因组 | 第42页 |
| 4.5.2 融合PCR技术介绍 | 第42-43页 |
| 4.5.3 上游同源臂的克隆 | 第43-44页 |
| 4.5.4 下游同源臂的克隆 | 第44页 |
| 4.5.5 Ura4标签克隆 | 第44-45页 |
| 4.5.6 融合PCR技术构建同源重组融合片段 | 第45-46页 |
| 4.5.7 目的基因isp6的敲除 | 第46页 |
| 4.5.8 醋酸锂转化法 | 第46页 |
| 4.5.9 基因组的提取和isp6基因敲除验证 | 第46-47页 |
| 4.5.10 菌种保藏 | 第47页 |
| 4.5.11 peno-GFAT-cpy-CPB1质粒的转化与表达 | 第47页 |
| 4.5.12 羧肽酶B提取与酶活测定 | 第47-48页 |
| 4.5.13 羧肽酶B表达的SDS-PAGE | 第48页 |
| 4.6 实验结果与讨论 | 第48-49页 |
| 4.6.1 基因组和同源臂 | 第48页 |
| 4.6.2 融合片段构建及目的基因isp6的敲除验证 | 第48-49页 |
| 4.6.3 羧肽酶B的SDS-PAGE检测及酶活检测 | 第49页 |
| 4.7 讨论 | 第49-51页 |
| 全文总结 | 第51-53页 |
| 参考文献 | 第53-58页 |
| 在读期间发表的学术论文及研究成果 | 第58-59页 |
| 致谢 | 第59页 |
