| 摘要 | 第8-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 第一章 文献综述 | 第11-21页 |
| 1. 抗体 | 第11-16页 |
| 1.1 重组抗体技术 | 第11-12页 |
| 1.2 基因工程单链抗体(scFv) | 第12-13页 |
| 1.3 scFv抗体的产生 | 第13页 |
| 1.4 scFv抗体片段的表达 | 第13-15页 |
| 1.5 scFv的应用 | 第15-16页 |
| 2. 绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP) | 第16-20页 |
| 2.1 绿色荧光蛋白基本概述 | 第16-17页 |
| 2.2 绿色荧光蛋白结构特征 | 第17-18页 |
| 2.3 绿色荧光蛋白的应用 | 第18-20页 |
| 3. 本研究的目的和意义 | 第20-21页 |
| 第二章 基于GFP的scFv不同功能区插入体的原核表达与纯化 | 第21-33页 |
| 引言 | 第21页 |
| 材料与方法 | 第21页 |
| 1. 材料 | 第21-22页 |
| 1.1 质粒与菌株 | 第21-22页 |
| 1.2 试剂与耗材 | 第22页 |
| 2. 方法 | 第22-26页 |
| 2.1 引物设计 | 第22页 |
| 2.2 质粒提取 | 第22页 |
| 2.3 PCR扩增 | 第22-23页 |
| 2.4 PCR产物的回收,酶切和连接 | 第23-24页 |
| 2.5 连接产物的转化 | 第24页 |
| 2.6 单克隆的验证 | 第24页 |
| 2.7 重组载体的诱导表达鉴定 | 第24-25页 |
| 2.8 目的蛋白的纯化 | 第25页 |
| 2.9 纯化蛋白浓度的标定 | 第25-26页 |
| 3. 结果与分析 | 第26-31页 |
| 3.1 重组载体的构建 | 第26-27页 |
| 3.2 PCR扩增基因 | 第27-28页 |
| 3.3 测序结果 | 第28-30页 |
| 3.4 蛋白的表达与纯化 | 第30-31页 |
| 4. 讨论 | 第31-32页 |
| 4.1 Loop 9的选择 | 第31页 |
| 4.2 重组载体的构建 | 第31页 |
| 4.3 不同形式scFv片段的插入对GFP荧光活性的影响 | 第31-32页 |
| 4.4 可溶性分析 | 第32页 |
| 5. 小结 | 第32-33页 |
| 第三章 scFv抗体作用区的鉴定 | 第33-40页 |
| 引言 | 第33页 |
| 材料与方法 | 第33页 |
| 1. 材料 | 第33页 |
| 1.1 实验试剂和材料 | 第33页 |
| 2. 方法 | 第33-36页 |
| 2.1 重组载体荧光强度的检测 | 第33页 |
| 2.2 蛋白浓度的测定 | 第33页 |
| 2.3 ELISA检测抗体作用区 | 第33-34页 |
| 2.4 竞争ELISA | 第34页 |
| 2.5 ELISA检测scFv关键作用区的特异性 | 第34-36页 |
| 3. 结果与分析 | 第36-39页 |
| 3.1 重组载体蛋白的荧光强度 | 第36页 |
| 3.2 抗体作用区的鉴定 | 第36-37页 |
| 3.3 竞争ELISA | 第37-38页 |
| 3.4 抗体作用区的特异性检测 | 第38-39页 |
| 4. 讨论 | 第39页 |
| 4.1 重组载体荧光强度的差异和抗体作用区的鉴定 | 第39页 |
| 4.2 抗体特异性的鉴定 | 第39页 |
| 5. 小结 | 第39-40页 |
| 第四章 scFv不同CDR功能区的研究 | 第40-51页 |
| 引言 | 第40页 |
| 材料与方法 | 第40页 |
| 1. 材料 | 第40-41页 |
| 1.1 质粒与菌株 | 第40-41页 |
| 1.2 试剂与耗材 | 第41页 |
| 2. 方法 | 第41-45页 |
| 2.1 引物设计 | 第41页 |
| 2.2 质粒提取 | 第41页 |
| 2.3 PCR扩增 | 第41-42页 |
| 2.4 PCR产物的回收,酶切和连接 | 第42页 |
| 2.5 连接产物的转化 | 第42页 |
| 2.6 单克隆的验证 | 第42-43页 |
| 2.7 重组载体的诱导表达鉴定 | 第43页 |
| 2.8 目的蛋白的纯化 | 第43页 |
| 2.9 纯化蛋白浓度的标定 | 第43-44页 |
| 2.10 ELISA检测 | 第44-45页 |
| 3. 结果与分析 | 第45-49页 |
| 3.1 重组载体的构建 | 第45-46页 |
| 3.2 目的蛋白的表达与纯化 | 第46-48页 |
| 3.3 ELISA检测 | 第48-49页 |
| 4. 讨论 | 第49-50页 |
| 4.1 不同CDR区的插入对GFP荧光及抗体活性的影响 | 第49页 |
| 4.2 不同CDR区插入抗体分子结合活性分析 | 第49-50页 |
| 5. 小结 | 第50-51页 |
| 第五章 氨基酸的定向突变对抗体亲和力的影响 | 第51-61页 |
| 引言 | 第51页 |
| 材料与方法 | 第51页 |
| 1. 材料 | 第51-52页 |
| 1.1 质粒与菌株 | 第51-52页 |
| 1.2 试剂与耗材 | 第52页 |
| 2. 方法 | 第52-54页 |
| 2.1 引物设计 | 第52-53页 |
| 2.2 质粒提取 | 第53页 |
| 2.3 PCR扩增 | 第53页 |
| 2.4 接下来的步骤和方法与第四章2.4-2.10相同 | 第53-54页 |
| 3. 结果与分析 | 第54-59页 |
| 3.1 重组载体的构建 | 第54页 |
| 3.2 重组载体的序列分析 | 第54-57页 |
| 3.3 ELISA检测 | 第57-59页 |
| 4. 讨论 | 第59-60页 |
| 4.1 丙氨酸扫描和赖氨酸突变 | 第59页 |
| 4.2 其它亲水性氨基酸的突变 | 第59-60页 |
| 5. 小结 | 第60-61页 |
| 第六章 抗体亲和力的测定和GFP抗体通用性的研究 | 第61-67页 |
| 引言 | 第61页 |
| 材料与方法 | 第61页 |
| 1. 材料 | 第61-62页 |
| 1.1 质粒与菌株 | 第61页 |
| 1.2 试剂与耗材 | 第61-62页 |
| 2. 方法 | 第62-63页 |
| 2.1 引物设计 | 第62页 |
| 2.2 质粒提取 | 第62页 |
| 2.3 PCR扩增 | 第62页 |
| 2.4 接下来的步骤和方法与第四章2.4-2.10相同 | 第62-63页 |
| 3. 结果与分析 | 第63-66页 |
| 3.1 抗体亲和力分析 | 第63页 |
| 3.2 重组载体的序列和SDS-PAGE分析 | 第63-65页 |
| 3.3 ELISA检测 | 第65-66页 |
| 4. 讨论 | 第66页 |
| 4.1 不同小分子毒素抗体CDR3插入的研究 | 第66页 |
| 4.2 突变体与野生型scFv的亲和力分析 | 第66页 |
| 5. 小结 | 第66-67页 |
| 结论 | 第67-68页 |
| 参考文献 | 第68-76页 |
| 致谢 | 第76-77页 |
| 附录 | 第77-80页 |
