| 中文摘要 | 第2-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 中文文摘 | 第6-14页 |
| 绪论 | 第14-24页 |
| 1 辅酶Q10概述 | 第14-16页 |
| 1.1 辅酶Q10的结构和理化性质 | 第14页 |
| 1.2 辅酶Q10的合成方法 | 第14-15页 |
| 1.3 辅酶Q10的研究进展 | 第15-16页 |
| 2 类球红细菌 | 第16-17页 |
| 2.1 类球红细菌的质粒 | 第16页 |
| 2.2 类球红细菌的操纵子 | 第16页 |
| 2.3 类球红细菌的遗传操作方法 | 第16-17页 |
| 3 温度敏感型质粒pBBR1MCS-2M | 第17-19页 |
| 3.1 质粒的不稳定性 | 第18页 |
| 3.2 质粒拷贝数 | 第18-19页 |
| 4 基因无痕敲除 | 第19-22页 |
| 4.1 同源重组 | 第19页 |
| 4.2 基因无痕敲除的载体类型 | 第19-20页 |
| 4.3 反向筛选标记 | 第20-21页 |
| 4.4 无痕基因替代法的基本原理 | 第21页 |
| 4.5 运用upp基因进行无痕敲除的研究进展 | 第21-22页 |
| 5 论文的选题依据和意义 | 第22-23页 |
| 6 研究内容 | 第23-24页 |
| 第一章 类球红细菌GY-2中ddsa基因的过表达 | 第24-46页 |
| 1 引言 | 第24页 |
| 2 材料与方法 | 第24-37页 |
| 2.1 材料 | 第24-27页 |
| 2.2 方法 | 第27-37页 |
| 3 结果 | 第37-44页 |
| 3.1 基因ddsa的PCR扩增 | 第37页 |
| 3.2 克隆载体pYC6a-ddsa的验证 | 第37-38页 |
| 3.3 载体骨架pBBR1MCS-2和目的片段tac-ddsa的PCR扩增 | 第38-39页 |
| 3.4 克隆载体pBBR1MCS2-tac-ddsa的验证 | 第39页 |
| 3.5 接合转移 | 第39页 |
| 3.6 CoQ10标准曲线 | 第39-40页 |
| 3.7 HPLC检测各菌株CoQ10含量 | 第40-41页 |
| 3.8 目的片段ddsa-his的PCR扩增 | 第41-42页 |
| 3.9 载体骨架pBBR1MCS2-tac的PCR扩增 | 第42页 |
| 3.10 克隆载体pBBR1MCS2-tac-ddsa-his的验证 | 第42页 |
| 3.11 接合实验的验证 | 第42-43页 |
| 3.12 HPLC检测各菌株CoQ10含量 | 第43-44页 |
| 3.13 Western blotting | 第44页 |
| 4 小结 | 第44-46页 |
| 第二章 温敏质粒丢失率及温敏位点的研究 | 第46-52页 |
| 1 引言 | 第46页 |
| 2 材料与方法 | 第46-47页 |
| 2.1 材料 | 第46页 |
| 2.2 方法 | 第46-47页 |
| 3 结果与分析 | 第47-50页 |
| 3.1 温敏质粒在宿主大肠杆菌中的丢失情况 | 第47-49页 |
| 3.2 温敏质粒在宿主类球红细菌GY-2中的丢失情况 | 第49-50页 |
| 4 小结 | 第50-52页 |
| 第三章 重组表达载体pYB1S-Mrep和pYB1S-rep的构建、表达与纯化 | 第52-66页 |
| 1 引言 | 第52页 |
| 2 材料与方法 | 第52-57页 |
| 2.1 材料 | 第52-54页 |
| 2.2 实验方法 | 第54-55页 |
| 2.3 构建质粒pYB1S-Mrep与pYB1S-rep | 第55-56页 |
| 2.4 克隆载体的转化 | 第56页 |
| 2.5 REP和MREP蛋白的表达 | 第56页 |
| 2.6 REP和MREP蛋白的纯化 | 第56-57页 |
| 2.7 REP和MREP蛋白的Hi Trap DEAE FF离子交换层析柱纯化 | 第57页 |
| 2.8 蛋白浓度的测定 | 第57页 |
| 2.9 圆二色谱 | 第57页 |
| 3 结果与分析 | 第57-64页 |
| 3.1 目的片段的克隆 | 第57-58页 |
| 3.2 克隆载体pYB1S-rep/pYB1S-Mrep的验证 | 第58-59页 |
| 3.3 REP和MREP蛋白的表达 | 第59-61页 |
| 3.4 REP和MREP蛋白的纯化 | 第61-62页 |
| 3.5 蛋白浓度的测定 | 第62-63页 |
| 3.6 圆二色谱 | 第63-64页 |
| 4 小结 | 第64-66页 |
| 第四章 荧光定量PCR测定E.coli T1中质粒的拷贝数 | 第66-78页 |
| 1 引言 | 第66页 |
| 2 材料与方法 | 第66-69页 |
| 2.1 材料 | 第66-67页 |
| 2.2 方法 | 第67-69页 |
| 3 结果与分析 | 第69-77页 |
| 3.1 基因dxs的PCR扩增 | 第69页 |
| 3.2 克隆载体pLB1K-dxs的验证 | 第69-70页 |
| 3.3 基因rep的PCR扩增 | 第70页 |
| 3.4 克隆载体pLB1K-dxs-rep的验证 | 第70-71页 |
| 3.5 引物特异性扩增的鉴定 | 第71-72页 |
| 3.6 标准曲线和扩增效率 | 第72-73页 |
| 3.7 △△C_T方法的验证 | 第73页 |
| 3.8 不同培养温度下pBBR1MCS-2质粒拷贝数的测定 | 第73-75页 |
| 3.9 不同培养温度下pBBR1MCS-2M质粒拷贝数的测定 | 第75-77页 |
| 4 小结 | 第77-78页 |
| 第五章 荧光定量PCR测定类球红细菌中质粒的拷贝数 | 第78-90页 |
| 1 引言 | 第78页 |
| 2 材料与方法 | 第78-81页 |
| 2.1 材料 | 第78页 |
| 2.2 引物的设计 | 第78-79页 |
| 2.3 构建标准质粒pLB1K-ddsa-rep | 第79-80页 |
| 2.4 实时荧光定量PCR | 第80-81页 |
| 2.5 构建质粒pLB1K-ddsa-rep的标准曲线 | 第81页 |
| 2.6 总DNA的提取 | 第81页 |
| 2.7 采用绝对定量和相对定量计算质粒拷贝数 | 第81页 |
| 3 结果与分析 | 第81-88页 |
| 3.1 基因ddsa的PCR扩增 | 第81-82页 |
| 3.2 克隆载体pLB1K-ddsa的验证 | 第82页 |
| 3.3 基因Grep的PCR扩增 | 第82页 |
| 3.4 克隆载体pLB1K-ddsa-rep的验证 | 第82-83页 |
| 3.5 引物特异性扩增的鉴定 | 第83-84页 |
| 3.6 标准曲线和扩增效率 | 第84页 |
| 3.7 不同培养温度下pBBR1MCS-2质粒拷贝数的测定 | 第84-86页 |
| 3.8 不同培养温度下pBBR1MCS-2M质粒拷贝数的测定 | 第86-88页 |
| 4 小结 | 第88-90页 |
| 第六章 利用温敏质粒pBBR1MCS-2M敲除upp基因 | 第90-102页 |
| 1 引言 | 第90页 |
| 2 材料与方法 | 第90-94页 |
| 2.1 材料 | 第90-91页 |
| 2.2 实验方法 | 第91-94页 |
| 3 结果与分析 | 第94-100页 |
| 3.1 基因UppUP和基因UppDN的PCR扩增 | 第94页 |
| 3.2 载体骨架pBBR1MCS-2M的PCR扩增 | 第94-95页 |
| 3.3 克隆载体pBBR1MCS-2M△upp的验证 | 第95页 |
| 3.4 缺失upp基因R.Sphaeroides GY-2的获得 | 第95-96页 |
| 3.5 缺失upp基因R.Sphaeroides GY-2的菌株的PCR鉴定 | 第96-97页 |
| 3.6 缺失upp基因R.Sphaeroides GY-2菌株中质粒残留的鉴定 | 第97-98页 |
| 3.7 upp基因缺陷互补型质粒载体系统的构建 | 第98-99页 |
| 3.8 生长曲线的测定 | 第99页 |
| 3.9 5-FU的致死率 | 第99-100页 |
| 4 小结 | 第100-102页 |
| 第七章 结论与展望 | 第102-104页 |
| 1 研究结论 | 第102-103页 |
| 2 展望 | 第103-104页 |
| 参考文献 | 第104-112页 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 | 第112-114页 |
| 致谢 | 第114-116页 |
| 个人简历 | 第116-118页 |
