| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 1. 文献综述 | 第13-25页 |
| 引言 | 第13页 |
| 1.1 植物的信号转导 | 第13-15页 |
| 1.1.1 植物细胞信号转导系统与环境胁迫 | 第14页 |
| 1.1.2 Ca~(2+)与蛋白质磷酸化/去磷酸化 | 第14-15页 |
| 1.2 植物Ca_(2+)相关蛋白激酶 | 第15-23页 |
| 1.2.1 植物Ca_(2+)蛋白激酶的分类、结构及其功能 | 第15-16页 |
| 1.2.2 植物钙依赖蛋白激酶CDPK的结构和功能 | 第16-23页 |
| 1.2.2.1 植物钙依赖蛋白激酶CDPK的结构 | 第16-17页 |
| 1.2.2.2 植物钙依赖蛋白激酶CDPK的功能 | 第17-23页 |
| 1.2.2.2.1 参与植物的生长发育 | 第18-19页 |
| 1.2.2.2.2 参与植物的碳、氮代谢 | 第19-20页 |
| 1.2.2.2.3 参与各种植物激素的信号转导 | 第20页 |
| 1.2.2.2.4 参与离子转运和气孔运动 | 第20-21页 |
| 1.2.2.2.5 对非生物逆境胁迫信号转导的调控 | 第21-22页 |
| 1.2.2.2.6 参与植物病害反应信号转导的调控 | 第22-23页 |
| 1.3 本研究的目的和意义 | 第23-24页 |
| 1.4 本研究技术路线 | 第24-25页 |
| 2. 材料与方法 | 第25-54页 |
| 2.1 材料与试剂 | 第25-26页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第25页 |
| 2.1.2 菌株及质粒载体 | 第25页 |
| 2.1.2.1 菌种 | 第25页 |
| 2.1.2.2 载体 | 第25页 |
| 2.1.3 生化试剂 | 第25页 |
| 2.1.4 常用培养基的配制 | 第25-26页 |
| 2.2 方法与步骤 | 第26-54页 |
| 2.2.1 橡胶树不同组织中总RNA的提取 | 第26-28页 |
| 2.2.1.1 准备工作 | 第26页 |
| 2.2.1.2 橡胶树胶乳Total RNA的提取 | 第26-27页 |
| 2.2.1.3 橡胶树树皮、树根、叶片Total RNA的提取 | 第27-28页 |
| 2.2.1.4 RNA电泳检测 | 第28页 |
| 2.2.2 cDNA的合成 | 第28-30页 |
| 2.2.2.1 5'-RACE-Ready cDNA的合成 | 第29页 |
| 2.2.2.2 3'-RACE-Ready cDNA的合成 | 第29-30页 |
| 2.2.3 5'RACE、3'RACE分别扩增HbCDPK1的5'端、3'端 | 第30-36页 |
| 2.2.3.1 HbCDPK1的5'端的PCR扩增 | 第30-31页 |
| 2.2.3.2 HbCDPK1的3'端的PCR扩增 | 第31页 |
| 2.2.3.3 PCR产物的回收 | 第31-32页 |
| 2.2.3.4 PCR目的片段的克隆及其重组子筛选 | 第32-36页 |
| 2.2.3.4.1 连接反应 | 第32页 |
| 2.2.3.4.2 CaCl_2法制备大肠杆菌Ecoli DH5α感受态细胞 | 第32-33页 |
| 2.2.3.4.3 感受态鉴定 | 第33页 |
| 2.2.3.4.4 转化 | 第33-34页 |
| 2.2.3.4.5 菌液PCR重组子的鉴定 | 第34-35页 |
| 2.2.3.4.6 质粒DNA的提取 | 第35-36页 |
| 2.2.3.4.7 重组子的酶切鉴定 | 第36页 |
| 2.2.3.4.8 重组子菌种的保存 | 第36页 |
| 2.2.4 HbCDPK1全长cDNA的PCR扩增 | 第36-38页 |
| 2.2.4.1 测序与全长序列拼接 | 第36页 |
| 2.2.4.2 引物设计 | 第36-37页 |
| 2.2.4.3 PCR扩增 | 第37-38页 |
| 2.2.4.4 PCR产物的回收 | 第38页 |
| 2.2.4.5 PCR目的片段的克隆及重组子的筛选 | 第38页 |
| 2.2.5 HbCDPK1启动子区域的扩增 | 第38-41页 |
| 2.2.5.1 叶片基因组DNA的提取 | 第38-39页 |
| 2.2.5.2 引物设计 | 第39页 |
| 2.2.5.3 叶片基因组DNA酶切 | 第39页 |
| 2.2.5.4 酶切基因组DNA的纯化 | 第39-40页 |
| 2.2.5.5 基因组DNA与GenomeWalker接头的连接 | 第40页 |
| 2.2.5.6 第一轮PCR扩增 | 第40页 |
| 2.2.5.7 第二轮PCR扩增 | 第40-41页 |
| 2.2.5.8 PCR产物的回收 | 第41页 |
| 2.2.5.9 目的片段的克隆及其重组子筛选 | 第41页 |
| 2.2.6 HbCDPK1的RT-PCR表达分析 | 第41-44页 |
| 2.2.6.1 材料的处理 | 第41页 |
| 2.2.6.2 处理材料RNA的提取 | 第41页 |
| 2.2.6.3 cDNA的合成 | 第41-42页 |
| 2.2.6.4 模板量的确定 | 第42页 |
| 2.2.6.5 指数增长期的确定 | 第42-43页 |
| 2.2.6.5.1 18S rRNA基因指数增长期的确定 | 第42-43页 |
| 2.2.6.5.2 HbCDPK1基因指数增长期的确定 | 第43页 |
| 2.2.6.6 RT-PCR分析 | 第43-44页 |
| 2.2.7 HbCDPK1基因的原核表达 | 第44-46页 |
| 2.2.7.1 表达载体的构建与鉴定 | 第44-45页 |
| 2.2.7.1.1 HbCDPK1基因的酶切 | 第44页 |
| 2.2.7.1.2 原核表达载体pET-30a(+)的酶切 | 第44页 |
| 2.2.7.1.3 目的片段与表达载体的连接 | 第44-45页 |
| 2.2.7.1.4 重组子的筛选鉴定 | 第45页 |
| 2.2.7.2 程菌的表达 | 第45-46页 |
| 2.2.7.3 重组蛋白的SDS-PAGE分析 | 第46页 |
| 2.2.8 重组蛋白的纯化与分析 | 第46-49页 |
| 2.2.8.1 重组蛋白的纯化 | 第46-47页 |
| 2.2.8.2 重组蛋白酶活性的分析 | 第47-48页 |
| 2.2.8.3 重组蛋白的凝胶迁移率变动分析 | 第48-49页 |
| 2.2.9 根癌农杆菌介导转化烟草 | 第49-54页 |
| 2.2.9.1 表达载体的构建与鉴定 | 第49-51页 |
| 2.2.9.1.1 HbCDPK1基因的酶切 | 第49-50页 |
| 2.2.9.1.2 植物表达载体pCAMBIA1304的酶切 | 第50页 |
| 2.2.9.1.3 目的片段与表达载体的连接 | 第50页 |
| 2.2.9.1.4 重组子的筛选鉴定 | 第50-51页 |
| 2.2.9.2 CaCl_2法制备根癌农杆菌感受态细胞 | 第51页 |
| 2.2.9.3 重组表达载体pCAMBIA1304-EUCDPK1液氮冻融法转化农杆菌感受态细胞 | 第51页 |
| 2.2.9.4 阳性农杆菌菌株的鉴定 | 第51页 |
| 2.2.9.5 工程菌的准备 | 第51-52页 |
| 2.2.9.6 转化受体的获取 | 第52页 |
| 2.2.9.7 侵染及移栽 | 第52页 |
| 2.2.9.8 共转化植株的检测 | 第52-54页 |
| 2.2.9.8.1 烟草基因组DNA的提取 | 第52页 |
| 2.2.9.8.2 共转化植株的PCR检测 | 第52-53页 |
| 2.2.9.8.3 转基因植株的荧光检测 | 第53-54页 |
| 3. 结果与分析 | 第54-80页 |
| 3.1 总RNA的提取与分析 | 第54页 |
| 3.2 HbCDPK1基因的克隆 | 第54-59页 |
| 3.2.1 5'RACE扩增HbCDPK1的5’端 | 第54-55页 |
| 3.2.2 3'RACE扩增HbCDPK1的3’端 | 第55页 |
| 3.2.3 HbCDPK1全长基因的克隆 | 第55-59页 |
| 3.3 HbCDPK1基因启动子区域的扩增 | 第59-63页 |
| 3.3.1 构建GenomeWalker文库与GenomeWalker DNA步移 | 第59-60页 |
| 3.3.2 HbCDPK1基因5'调控区域的序列分析 | 第60-63页 |
| 3.4 HbCDPK1的生物信息学分析 | 第63-70页 |
| 3.4.1 HbCDPK1蛋白质的特征分析 | 第63-65页 |
| 3.4.2 HbCDPK1蛋白质疏水性、信号肽、二级结构、跨膜区域的预测 | 第65-68页 |
| 3.4.2.1 HbCDPK1蛋白质疏水性与信号肽的预测 | 第65-67页 |
| 3.4.2.2 HbCDPK1蛋白质二级结构、跨膜区域的预测 | 第67-68页 |
| 3.4.3 HbCDPK1的系统进化树分析 | 第68-69页 |
| 3.4.4 HbCDPK1的亚细胞定位和功能预测 | 第69-70页 |
| 3.5 HbCDPK1的RT-PCR分析 | 第70-72页 |
| 3.5.1 HbCDPK1的组织特异性表达分析 | 第70-71页 |
| 3.5.2 不同处理(诱导、胁迫)对HbCDPK1的表达影响 | 第71-72页 |
| 3.6 HbCDPK1的原核表达 | 第72-77页 |
| 3.6.1 原核表达载体的构建 | 第72-73页 |
| 3.6.2 HbCDPK1的原核表达 | 第73-75页 |
| 3.6.2.1 HbCDPK1(全长序列)的表达 | 第73-74页 |
| 3.6.2.2 HbCDPK1(缺失序列)的表达 | 第74-75页 |
| 3.6.3 pET-30a-EHbCDPK1重组蛋白酶活性的测定 | 第75-76页 |
| 3.6.4 pET-30a-EHbCDPK1与pET-30a-ECDPK1重组蛋白的凝胶迁移率变动分析 | 第76-77页 |
| 3.7 根癌农杆菌介导的HbCDPK1转化烟草 | 第77-80页 |
| 3.7.1 构建植物表达载体 | 第77页 |
| 3.7.2 烟草的转化 | 第77-78页 |
| 3.7.3 转基因阳性植株的鉴定 | 第78-79页 |
| 3.7.4 绿色荧光蛋白(GFP)的检测 | 第79-80页 |
| 4. 讨论 | 第80-83页 |
| 4.1 关于胶乳的采集方法 | 第80页 |
| 4.2 关于HbCDPK1的功能 | 第80-82页 |
| 4.3 关于HbCDPK1基因5'端调控序列 | 第82-83页 |
| 5. 结果与结论 | 第83-85页 |
| 5.1 研究结果 | 第83页 |
| 5.2 结论 | 第83-85页 |
| 参考文献 | 第85-94页 |
| 缩略词表 | 第94-95页 |
| 致谢 | 第95页 |
