| 摘要 | 第5-8页 |
| Abstract | 第8-11页 |
| 前言 | 第27-53页 |
| 1 O-GlcNAc的生物合成 | 第27-34页 |
| 1.1 己糖胺生物合成途径(Hexosamine Biosynthetic Pathway-HBP) | 第28-29页 |
| 1.2 O-GlcNAc转移酶(OGT) | 第29-32页 |
| 1.3 O-GlcNAc糖苷酶(OGA) | 第32-34页 |
| 2 O-GlcNAc是一种动态修饰 | 第34-35页 |
| 3 O-GlcNAc修饰的检测方法 | 第35-37页 |
| 3.1 抗体检测法 | 第35页 |
| 3.2 代谢标记检测法 | 第35-36页 |
| 3.3 半乳糖基转移酶标记检测法 | 第36页 |
| 3.4 凝集素法 | 第36页 |
| 3.5 QUIC-Tag质谱检测法 | 第36-37页 |
| 4 O-GlcNAc调节蛋白质的功能 | 第37-43页 |
| 4.1 O-GlcNAc调节蛋白质磷酸化 | 第37-39页 |
| 4.2 O-GlcNAc调节蛋白质降解 | 第39-40页 |
| 4.3 O-GlcNAc调节蛋白质定位 | 第40-41页 |
| 4.4 O-GlcNAc调节蛋白之间相互作用 | 第41-42页 |
| 4.5 O-GlcNAc调节转录 | 第42-43页 |
| 5 O-GlcNAc的生物学功能 | 第43-44页 |
| 5.1 细胞周期调节 | 第43页 |
| 5.2 压力应激 | 第43-44页 |
| 6 O-GlcNAc修饰异常与疾病 | 第44-45页 |
| 7 p120-catenin(p120) | 第45-53页 |
| 7.1 p120亚型 | 第46-47页 |
| 7.2 p120调节核内信号通路 | 第47-48页 |
| 7.3 p120调节胞浆中信号通路 | 第48-49页 |
| 7.4 p120调节RhoGTP酶活性 | 第49页 |
| 7.5 p120调节钙黏着蛋白(cadherin)的运输和稳定性 | 第49-51页 |
| 7.5.1 p120与cadherin的生物合成 | 第49页 |
| 7.5.2 p120稳定细胞表面的cadherin | 第49-50页 |
| 7.5.3 p120避免cadherin内吞 | 第50-51页 |
| 7.6 p120与磷酸化 | 第51页 |
| 7.7 p120与癌症 | 第51-53页 |
| 第一章 O-GlcNAc修饰对p120与E-cadherin相互作用的影响 | 第53-76页 |
| 第一节 O-GlcNAc修饰水平降低和升高细胞株的构建 | 第53-66页 |
| 1 实验材料 | 第53-54页 |
| 1.1 细胞株 | 第53页 |
| 1.2 菌种和载体 | 第53页 |
| 1.3 主要试剂 | 第53-54页 |
| 2 主要仪器 | 第54页 |
| 3 实验方法 | 第54-60页 |
| 3.1 人OGT干扰载体的构建 | 第54-58页 |
| 3.1.1 人OGT shRNA片段的设计 | 第56页 |
| 3.1.2 RNA干扰寡核苷酸片段的退火 | 第56-57页 |
| 3.1.3 碱裂解法提取质粒 | 第57页 |
| 3.1.4 酶切pLK0.1-puro质粒 | 第57页 |
| 3.1.5 胶回收载体片段 | 第57页 |
| 3.1.6 连接 | 第57-58页 |
| 3.1.7 转化 | 第58页 |
| 3.1.8 筛选鉴定阳性克隆 | 第58页 |
| 3.2 构建人OGT沉默细胞株 | 第58-60页 |
| 3.2.1 细胞培养 | 第58页 |
| 3.2.2 制备和收集病毒 | 第58页 |
| 3.2.3 病毒感染细胞和阳性细胞筛选 | 第58-59页 |
| 3.2.4 提取细胞总RNA | 第59页 |
| 3.2.5 反转录PCR制备cDNA | 第59页 |
| 3.2.6 Real-time PCR | 第59-60页 |
| 3.2.7 Western blot检测 | 第60页 |
| 4 实验结果 | 第60-66页 |
| 4.1 人OGT稳定沉默细胞株 | 第60页 |
| 4.2 RT-PCR检测OGT的沉默效率 | 第60-61页 |
| 4.3 WB检测沉默细胞株OGT蛋白表达 | 第61-62页 |
| 4.4 O-GlcNAc修饰水平的检测 | 第62-63页 |
| 4.5 O-GlcNAc修饰增加的细胞株的构建 | 第63-66页 |
| 5 讨论 | 第66页 |
| 6 小结 | 第66页 |
| 第二节 O-GlcNAc修饰对p120与E-cadherin相互作用的影响 | 第66-76页 |
| 1 实验材料 | 第66-69页 |
| 1.1 细胞株 | 第66页 |
| 1.2 菌种和载体 | 第66页 |
| 1.3 主要试剂 | 第66-67页 |
| 1.4 主要试剂的配置 | 第67-68页 |
| 1.5 主要仪器 | 第68-69页 |
| 2 实验方法 | 第69-71页 |
| 2.1 细胞培养与传代 | 第69页 |
| 2.2 Thiamet G处理细胞增加O-GlcNAc | 第69页 |
| 2.3 免疫荧光检测法 | 第69页 |
| 2.4 质粒瞬时转染 | 第69-70页 |
| 2.5 免疫印迹(Western blotting,WB) | 第70页 |
| 2.6 细胞骨架结合蛋白的提取 | 第70-71页 |
| 2.7 免疫共沉淀 | 第71页 |
| 3 实验结果 | 第71-74页 |
| 3.1 O-GlcNAc修饰抑制p120的膜定位 | 第71-72页 |
| 3.2 O-GlcNAc修饰降低p120和E-cadherin的骨架分布 | 第72-73页 |
| 3.3 O-GlcNAc修饰抑制p120和E-cadherin的体内相互作用 | 第73-74页 |
| 4 讨论 | 第74-75页 |
| 5 小结 | 第75-76页 |
| 第二章 p120的O-GlcNAc修饰对p120与E-cadherin相互作用的影响 | 第76-119页 |
| 第一节 p120的O-GlcNAc修饰 | 第76-93页 |
| 1 实验材料 | 第76-78页 |
| 1.1 细胞株 | 第76页 |
| 1.2 菌种和载体 | 第76-77页 |
| 1.3 主要试剂 | 第77页 |
| 1.4 主要溶液的配置 | 第77-78页 |
| 2 主要仪器 | 第78页 |
| 3 实验方法 | 第78-86页 |
| 3.1 p120表达载体的构建 | 第78-81页 |
| 3.2 p120表达细胞株的构建 | 第81-82页 |
| 3.2.1 瞬时转染p120表达载体 | 第81页 |
| 3.2.2 构建稳定表达p120的细胞株 | 第81-82页 |
| 3.3 p120与OGT的原核共表达菌株的构建 | 第82-84页 |
| 3.3.1 p120的原核诱导表达 | 第82页 |
| 3.3.2 p120与OGT的原核共表达 | 第82-83页 |
| 3.3.3 原核表达His-p120的分离纯化 | 第83页 |
| 3.3.4 原核表达MBP-OGT的分离纯化 | 第83-84页 |
| 3.4 免疫沉淀和蛋白质分离纯化 | 第84页 |
| 3.4.1 细胞内源p120免疫沉淀 | 第84页 |
| 3.4.2 外源表达Flag-p120的分离纯化 | 第84页 |
| 3.5 蛋白质的糖基化检测 | 第84-86页 |
| 3.5.1 抗体法和sWGA-agarose法检测糖基化 | 第85页 |
| 3.5.2 代谢标记法检测糖链 | 第85页 |
| 3.5.3 酶标记法检测糖链 | 第85页 |
| 3.5.4 O-GlcNAc的体外修饰 | 第85-86页 |
| 4 实验结果 | 第86-92页 |
| 4.1 HEK293T细胞中内源p120的O-GlcNAc修饰 | 第86-87页 |
| 4.2 不同细胞中外源表达Flag-p120的O-GlcNAc修饰 | 第87-90页 |
| 4.2.1 HEK293T细胞中外源p120的O-GlcNAc修饰 | 第87-88页 |
| 4.2.2 H1299细胞中外源p120的O-GlcNAc修饰 | 第88-89页 |
| 4.2.3 A549细胞中外源p120的O-GlcNAc修饰 | 第89-90页 |
| 4.3 大肠杆菌BL21中OGT对p120的O-GlcNAc修饰 | 第90-92页 |
| 4.3.1 p120与OGT在大肠杆菌BL21中的诱导表达 | 第90页 |
| 4.3.2 单表达p120和共表达p120/OGT的BL21菌种中p120的分离纯化 | 第90-91页 |
| 4.3.3 BL21中OGT对p120的O-GlcNAc修饰 | 第91-92页 |
| 4.4 p120的体外O-GlcNAc修饰 | 第92页 |
| 5 讨论 | 第92-93页 |
| 6 小结 | 第93页 |
| 第二节 p120 O-GlcNAc修饰主要区域的确定 | 第93-104页 |
| 1 实验材料 | 第93-94页 |
| 1.1 细胞株 | 第93页 |
| 1.2 菌种和载体 | 第93页 |
| 1.3 主要试剂 | 第93-94页 |
| 2 主要仪器 | 第94页 |
| 3 实验方法 | 第94-97页 |
| 3.1 p120截短突变体的构建 | 第94-97页 |
| 3.2 p120截短突变体的表达与纯化 | 第97页 |
| 3.3 代谢标记法检测糖基化修饰 | 第97页 |
| 4 实验结果 | 第97-103页 |
| 4.1 Flag-p120截短突变体的表达 | 第97-98页 |
| 4.2 GST-p120截短突变体的表达 | 第98-99页 |
| 4.3 代谢标记法检测GST的O-GlcNAc修饰本底信号 | 第99-100页 |
| 4.4 代谢标记法检测3xFlag-Nus的O-GlcNAc修饰本底信号 | 第100页 |
| 4.5 p3xFlag-Nus-p120截短突变体的表达 | 第100-101页 |
| 4.6 代谢标记法检测3xFlag-Nus-p120截短突变体的O-GlcNAc修饰信号 | 第101-102页 |
| 4.7 代谢标记法检测F2上主要的O-GlcNAc修饰信号 | 第102-103页 |
| 4.8 代谢标记法检测F3上主要的O-GlcNAc修饰信号 | 第103页 |
| 5 讨论 | 第103-104页 |
| 6 小结 | 第104页 |
| 第三节 p120的O-GlcNAc修饰抑制其与E-cadherin的相互作用 | 第104-115页 |
| 1 实验材料 | 第104-106页 |
| 1.1 细胞株 | 第104页 |
| 1.2 菌种和载体 | 第104-105页 |
| 1.3 主要试剂 | 第105页 |
| 1.4 主要试剂的配置 | 第105-106页 |
| 2 实验方法 | 第106-108页 |
| 2.1 E-cadherin粘附复合体结合的p120 O-GlcNAc修饰的检测 | 第106页 |
| 2.2 GST-ECD(E-cadherin胞浆区)的表达与纯化 | 第106-107页 |
| 2.3 O-GlcNAc修饰水平不同的p120蛋白的获得 | 第107-108页 |
| 2.4 Flag-p120与GST-ECD的体外结合分析 | 第108页 |
| 3 实验结果 | 第108-114页 |
| 3.1 抗体法检测E-cadherin粘附复合体结合与非结合的内源p120的O-GlcNAc修饰 | 第108页 |
| 3.2 抗体法检测E-cadherin粘附复合体结合与非结合的外源p120的O-GlcNAc修饰 | 第108-110页 |
| 3.3 代谢标记法检测E-cadherin粘附复合体结合与非结合的外源p120的O-GlcNAc修饰 | 第110页 |
| 3.4 O-GlcNAc修饰水平不同的p120蛋白与ECD的体外结合 | 第110-114页 |
| 3.4.1 GST-ECD蛋白的表达纯化 | 第111页 |
| 3.4.2 单表达p120与共表达p120/OGT获得的0-GlcNAc修饰水平不同的Flag-p120蛋白及其与GST-ECD的体外结合分析 | 第111-112页 |
| 3.4.3 采用不同细胞裂解液得到O-GlcNAc修饰水平不同的Flag-p120蛋白及其与GST-ECD的体外结合分析 | 第112-114页 |
| 4 讨论 | 第114-115页 |
| 5 小结 | 第115页 |
| 第四节 p120 Armadillo区的O-GlcNAc修饰抑制其与E-cadherin的相互作用 | 第115-119页 |
| 1 实验材料 | 第115页 |
| 1.1 细胞株 | 第115页 |
| 1.2 菌种与载体 | 第115页 |
| 1.3 主要试剂 | 第115页 |
| 2 实验方法 | 第115页 |
| 2.1 GST-ECD(E-cadherin胞浆区)的表达与纯化 | 第115页 |
| 2.2 O-GlcNAc修饰水平不同的p120 Armadillo区肽段的获得 | 第115页 |
| 2.3 Armadillo肽段与GST-ECD的体外结合分析 | 第115页 |
| 3 实验结果 | 第115-117页 |
| 3.1 单表达Armadillo与共表达Armadillo/OGT获得的O-GlcNAc修饰水平不同的Armadillo肽段及其与GST-ECD的体外结合分析 | 第116页 |
| 3.2 采用不同细胞裂解液获得O-GlcNAc修饰水平不同的Armadillo肽段及其与GST-ECD的体外结合分析 | 第116-117页 |
| 4 讨论 | 第117-118页 |
| 5 小结 | 第118-119页 |
| 第三章 OGT通过与p120相互作用抑制E-cadherin粘附复合体的形成 | 第119-142页 |
| 第一节 OGT与p120的相互作用 | 第119-123页 |
| 1 实验材料 | 第119页 |
| 1.1 细胞株 | 第119页 |
| 1.2 菌种和载体 | 第119页 |
| 1.3 主要试剂 | 第119页 |
| 2 实验方法 | 第119-121页 |
| 2.1 Flag-p120免疫共沉淀OGT | 第120页 |
| 2.2 Flag-OGT免疫共沉淀p120 | 第120页 |
| 2.3 Flag-OGT的表达与纯化 | 第120页 |
| 2.4 GST-p120表达载体的构建 | 第120-121页 |
| 2.5 GST-p120的表达与纯化 | 第121页 |
| 2.6 Flag-OGT Pulldown GST-p120 | 第121页 |
| 3 实验结果 | 第121-123页 |
| 3.1 Flag-p120免疫共沉淀OGT | 第121-122页 |
| 3.2 Flag-OGT免疫共沉淀p120 | 第122页 |
| 3.3 Flag-OGT Pulldown GST-p120 | 第122-123页 |
| 4 讨论 | 第123页 |
| 5 小结 | 第123页 |
| 第二节 p120与OGT相互作用区域的确定 | 第123-128页 |
| 1 实验材料 | 第123-124页 |
| 1.1 细胞株 | 第123页 |
| 1.2 菌种和载体 | 第123-124页 |
| 1.3 主要试剂 | 第124页 |
| 2 实验方法 | 第124-125页 |
| 2.1 HEK293T细胞表达GST-p120突变体Pulldown细胞内源OGT | 第124页 |
| 2.2 GST-p120突变体原核表达载体的构建、表达与纯化 | 第124-125页 |
| 2.3 BL21表达纯化的GST-p120突变体Pulldown HEK293T细胞中OGT | 第125页 |
| 2.4 HEK293T细胞表达纯化的Flag-OGT Pulldown BL21表达纯化的GST-p120突变体 | 第125页 |
| 3 实验结果 | 第125-127页 |
| 3.1 HEK293T细胞表达GST-p120突变体与细胞内源OGT的相互作用 | 第125-126页 |
| 3.2 BL21表达纯化的GST-p120突变体与HEK293T细胞中OGT的相互作用 | 第126-127页 |
| 3.3 HEK293T细胞表达纯化的Flag-OGT与BL21表达纯化的GST-p120突变体的相互作用 | 第127页 |
| 4 讨论 | 第127-128页 |
| 5 小结 | 第128页 |
| 第三节 OGT抑制p120与E-cadherin的体外相互作用 | 第128-134页 |
| 1 实验材料 | 第128-129页 |
| 1.1 细胞株 | 第128页 |
| 1.2 菌种和载体 | 第128页 |
| 1.3 主要试剂 | 第128-129页 |
| 1.4 主要试剂的配置 | 第129页 |
| 2 实验方法 | 第129-131页 |
| 2.1 his-p120的表达载体的构建 | 第129页 |
| 2.2 his-p120的表达与纯化 | 第129-130页 |
| 2.3 MBP-OGT的表达与纯化 | 第130页 |
| 2.4 GST-ECD的表达与纯化 | 第130-131页 |
| 2.5 MBP-OGT、his-p120与GST-ECD的体外结合实验 | 第131页 |
| 2.6 细胞骨架结合蛋白的提取 | 第131页 |
| 2.7 免疫共沉淀 | 第131页 |
| 3 实验结果 | 第131-134页 |
| 3.1 体外OGT与p120结合但不能与E-cadherin结合 | 第131-132页 |
| 3.2 体内OGT不能与E-cadherin粘附复合体结合 | 第132页 |
| 3.3 体外OGT竞争性抑制p120与E-cadherin的结合 | 第132-134页 |
| 4 小结 | 第134页 |
| 第四节 OGT抑制E-cadherin粘附复合体的形成 | 第134-142页 |
| 1 实验材料 | 第134页 |
| 1.1 细胞株 | 第134页 |
| 1.2 菌种和载体 | 第134页 |
| 1.3 主要试剂 | 第134页 |
| 2 实验方法 | 第134-135页 |
| 2.1 OGT突变体的构建 | 第134-135页 |
| 2.2 Flag-OGT免疫共沉淀p120 | 第135页 |
| 2.3 细胞骨架结合蛋白的提取 | 第135页 |
| 3 实验结果 | 第135-139页 |
| 3.1 p120与野生型OGT和突变型OGT的相互作用 | 第135-137页 |
| 3.2 突变型OGT H558A对E-cadherin粘附复合体形成的影响 | 第137-138页 |
| 3.3 Thiamet G处理OGT沉默细胞对骨架结合E-cadherin的影响 | 第138-139页 |
| 4 小结 | 第139页 |
| 5 讨论 | 第139-142页 |
| 参考文献 | 第142-157页 |
| 个人简历 | 第157-158页 |
| 发表论文 | 第158-159页 |
| 致谢 | 第159页 |
