| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5页 |
| 第一章 前言 | 第10-16页 |
| 1.1 副溶血弧菌的研究进展 | 第10-13页 |
| 1.1.1 副溶血弧菌的生长特性 | 第10-11页 |
| 1.1.2 副溶血弧菌致病机理和主要毒力因子 | 第11-12页 |
| 1.1.3 预防副溶血弧菌感染方法 | 第12页 |
| 1.1.4 副溶血弧菌研究现状 | 第12-13页 |
| 1.2 过氧化氢酶的研究进展 | 第13-14页 |
| 1.2.1 过氧化氢酶的来源 | 第13-14页 |
| 1.2.2 过氧化氢酶的应用 | 第14页 |
| 1.3 本课题的研究目的和创新 | 第14-16页 |
| 第二章 过氧化氢酶cat VPF1和cat VPR2的克隆和重组菌的构建 | 第16-26页 |
| 2.1 材料 | 第16-17页 |
| 2.1.1 菌株及培养条件 | 第16页 |
| 2.1.2 质粒 | 第16-17页 |
| 2.2 常用缓冲液 | 第17页 |
| 2.3 分子试剂 | 第17-18页 |
| 2.4 实验方法 | 第18-22页 |
| 2.4.1 大肠杆菌质粒DNA的制备及提取 | 第18页 |
| 2.4.2 细菌基因组DNA的制备 | 第18-19页 |
| 2.4.3 质粒DNA的操作 | 第19页 |
| 2.4.4 表达载体构建 | 第19-20页 |
| 2.4.5 感受态细胞的制备与转化 | 第20-21页 |
| 2.4.6 重组菌的筛选与鉴定 | 第21-22页 |
| 2.4.7 菌种保藏与测序 | 第22页 |
| 2.5 结果 | 第22-25页 |
| 2.5.1 副溶血弧菌基因组的提取 | 第22-23页 |
| 2.5.2 PCR扩增cat基因及纯化 | 第23-24页 |
| 2.5.3 重组质粒载体的构建 | 第24页 |
| 2.5.4 重组菌的鉴定结果 | 第24-25页 |
| 2.5.5 菌种保藏测序 | 第25页 |
| 2.6 讨论 | 第25-26页 |
| 第三章 过氧化氢酶cat VPF1和cat VPR2的表达条件优化和活性测定 | 第26-37页 |
| 3.1 常用试剂 | 第26页 |
| 3.1.1 蛋白纯化缓冲液 | 第26页 |
| 3.1.2 其他常用试剂 | 第26页 |
| 3.2 蛋白诱导表达纯化及定量 | 第26-29页 |
| 3.2.1 目的蛋白诱导表达 | 第26-27页 |
| 3.2.2 目的蛋白纯化 | 第27页 |
| 3.2.3 SDS-PAGE检测蛋白纯化效果 | 第27-28页 |
| 3.2.4 蛋白含量的测定 | 第28-29页 |
| 3.3 蛋白酶活力的测定 | 第29-30页 |
| 3.4 实验结果 | 第30-35页 |
| 3.4.1 SDS-PAGE电泳检测蛋白诱导及纯化效果 | 第30-31页 |
| 3.4.2 蛋白浓度测定结果 | 第31-33页 |
| 3.4.3 过氧化氢蛋白酶活测定 | 第33-34页 |
| 3.4.4 蛋白表达条件优化结果 | 第34-35页 |
| 3.5 讨论 | 第35-37页 |
| 第四章 cat基因缺失菌株的构建与鉴定 | 第37-43页 |
| 4.1 试验材料和方法 | 第37-40页 |
| 4.1.1 试验材料 | 第37页 |
| 4.1.2 目的基因敲除和回补 | 第37-38页 |
| 4.1.3 缺失菌的构建 | 第38-39页 |
| 4.1.4 回补菌的构建 | 第39-40页 |
| 4.2 实验结果 | 第40-42页 |
| 4.2.1 基因敲除与缺失菌株的构建 | 第40-41页 |
| 4.2.2 缺失菌株的鉴定 | 第41-42页 |
| 4.3 讨论 | 第42-43页 |
| 第五章 野生型菌株与突变体菌株的生长特性研究 | 第43-52页 |
| 5.1 基因缺失菌株的生长曲线测定 | 第43-45页 |
| 5.1.1 材料与方法 | 第43页 |
| 5.1.2 结果 | 第43-45页 |
| 5.1.3 讨论 | 第45页 |
| 5.2 各表型菌在氧化环境下生长特性研究 | 第45-48页 |
| 5.2.1 滤纸片法测定各表型菌在过氧化氢存在下的抑菌圈 | 第45-46页 |
| 5.2.2 各表型菌抑菌圈结果与分析 | 第46-48页 |
| 5.3 各表型菌在不同过氧化物环境下生长状况探究 | 第48-51页 |
| 5.3.1 各表型弧菌在高浓度过氧化氢环境中的生长状况 | 第48-49页 |
| 5.3.2 各表型弧菌在高浓度异丙苯环境中的生长状况 | 第49-50页 |
| 5.3.3 各表型弧菌在高浓度的叔丁基过氧化氢环境中生长状况 | 第50-51页 |
| 5.4 结论与分析 | 第51-52页 |
| 第六章 cat在氧化胁迫下对副溶血弧菌VP110基因的调控 | 第52-62页 |
| 6.1 材料与方法 | 第52-53页 |
| 6.1.1 试验材料 | 第52页 |
| 6.1.2 细菌RNA提取和反转录 | 第52-53页 |
| 6.2 有氧环境下cat在氧化胁迫下对基因表达的调控 | 第53-55页 |
| 6.2.1 副溶血弧菌总RNA提取与定量 | 第53-54页 |
| 6.2.2 基因组DNA的去除及c DNA的合成 | 第54页 |
| 6.2.3 RT-PCR | 第54-55页 |
| 6.3 无氧环境下cat在氧化胁迫下对基因表达的调控 | 第55-56页 |
| 6.3.1 无氧环境氧化胁迫下副溶血弧菌总RNA提取与定量 | 第55页 |
| 6.3.2 基因组DNA的去除及c DNA的合成 | 第55-56页 |
| 6.3.3 q PCR | 第56页 |
| 6.4 结果与分析 | 第56-62页 |
| 6.4.1 有氧环境氧化胁迫下副溶血弧菌VP110总RNA的提取 | 第56-57页 |
| 6.4.2 Real-Time PCR方法检测cat基因在有氧环境氧化胁迫下的转录水平 | 第57-59页 |
| 6.4.3 无氧环境下副溶血弧菌VP110总RNA的提取 | 第59页 |
| 6.4.4 Real-Time PCR方法检测cat基因在无氧环境下的转录水平 | 第59-62页 |
| 第七章 总结与讨论 | 第62-63页 |
| 致谢 | 第63-64页 |
| 参考文献 | 第64-71页 |
| 附录一 攻读硕士期间发表论文目录 | 第71-72页 |
| 缩略语表 | 第72页 |
