| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 文献综述 | 第11-21页 |
| 1.1 咖啡因及其代谢产物 | 第11-13页 |
| 1.2 咖啡因的用途与危害 | 第13-14页 |
| 1.2.1 咖啡因的用途 | 第13页 |
| 1.2.2 咖啡因危害 | 第13-14页 |
| 1.3 脱咖啡因方法研究进展 | 第14-15页 |
| 1.3.1 溶剂萃取法 | 第14页 |
| 1.3.2 吸附法 | 第14-15页 |
| 1.3.3 微波提取法 | 第15页 |
| 1.3.4 超临界二氧化碳提取法(SFE法) | 第15页 |
| 1.3.5 生物降解法 | 第15页 |
| 1.4 生物降解咖啡因的研究进展 | 第15-19页 |
| 1.4.1 降解咖啡因微生物种类 | 第15-16页 |
| 1.4.2 咖啡因降解机制 | 第16-17页 |
| 1.4.2.1 N-脱甲基途径 | 第16-17页 |
| 1.4.2.2 C-8位氧化途径 | 第17页 |
| 1.4.3 降解相关酶类研究进展 | 第17-19页 |
| 1.4.3.1 N-脱甲基酶 | 第17-18页 |
| 1.4.3.2 氧化酶 | 第18-19页 |
| 1.5 本课题的研究意义及研究内容 | 第19-21页 |
| 1.5.1 研究意义 | 第19页 |
| 1.5.2 研究内容 | 第19-21页 |
| 第二章 CF1差异转录组测序 | 第21-37页 |
| 2.1 转录组测序 | 第21页 |
| 2.2 实验步骤 | 第21-23页 |
| 2.2.1 Illumina测序 | 第21-22页 |
| 2.2.1.1 培养基 | 第21-22页 |
| 2.2.1.2 样品制备与处理 | 第22页 |
| 2.2.2 数据过滤及统计 | 第22页 |
| 2.2.3 生物信息学分析 | 第22-23页 |
| 2.3 结果与分析 | 第23-35页 |
| 2.3.1 测序结果统计 | 第23-24页 |
| 2.3.2 数据拼接结果 | 第24-25页 |
| 2.3.3 基因功能注释 | 第25-30页 |
| 2.3.4 Unigene表达差异分析 | 第30-32页 |
| 2.3.5 差异Unigene的GO和Pathway分析 | 第32-35页 |
| 2.4 讨论 | 第35-37页 |
| 第三章 cdnB和cdnD的基因克隆及qRT-PCR | 第37-57页 |
| 3.1 引言 | 第37页 |
| 3.2 材料 | 第37-43页 |
| 3.2.1 菌株与质粒 | 第37-38页 |
| 3.2.2 仪器 | 第38-39页 |
| 3.2.3 药品 | 第39-41页 |
| 3.2.4 培养基与试剂 | 第41-43页 |
| 3.3 方法 | 第43-51页 |
| 3.3.1 提取菌体基因组DNA | 第43页 |
| 3.3.2 目的基因cdnB和cdnD的体外扩增及验证 | 第43-45页 |
| 3.3.2.1 设计引物及扩增目的基因 | 第43-44页 |
| 3.3.2.2 琼脂糖凝胶电泳检测及胶回收 | 第44-45页 |
| 3.3.3 克隆质粒构建 | 第45-48页 |
| 3.3.3.1 载体连接 | 第45页 |
| 3.3.3.2 感受态制备 | 第45-46页 |
| 3.3.3.3 质粒DNA转化(快转) | 第46页 |
| 3.3.3.4 菌液PCR进行克隆检测 | 第46-47页 |
| 3.3.3.5 质粒提取(碱裂解法) | 第47-48页 |
| 3.3.4 qRT-PCR | 第48-51页 |
| 3.3.4.1 引物设计 | 第48页 |
| 3.3.4.2 RNA提取 | 第48-49页 |
| 3.3.4.3 RNA样品质量检测 | 第49页 |
| 3.3.4.4 RNA反转录及RT-PCR | 第49-50页 |
| 3.3.4.5 实时荧光定量检测 | 第50-51页 |
| 3.4 结果与分析 | 第51-56页 |
| 3.5 本章小结 | 第56-57页 |
| 第四章 原核表达体系的构建 | 第57-77页 |
| 4.1 引言 | 第57页 |
| 4.2 材料 | 第57-59页 |
| 4.2.1 菌株和质粒 | 第57-58页 |
| 4.2.2 仪器 | 第58页 |
| 4.2.3 试剂与药品 | 第58-59页 |
| 4.3 方法 | 第59-65页 |
| 4.3.1 原核表达载体pET32a-cdnB和pET32a-cdnD的构建 | 第59-60页 |
| 4.3.2 感受态细胞的制备 | 第60-61页 |
| 4.3.3 质粒DNA转化及验证 | 第61页 |
| 4.3.4 表达蛋白SDS-PAGE检测 | 第61-62页 |
| 4.3.4.1 样品准备 | 第61-62页 |
| 4.3.4.2 SDS-PAGE凝胶制备与电泳检测 | 第62页 |
| 4.3.5 目的蛋白诱导表达条件优化 | 第62-63页 |
| 4.3.6 表达蛋白活性测定 | 第63-65页 |
| 4.3.6.1 粗酶液制备 | 第63-64页 |
| 4.3.6.2 蛋白浓度分析 | 第64页 |
| 4.3.6.3 各种甲基黄嘌呤标准曲线的制备 | 第64页 |
| 4.3.6.4 CdnD酶活性检测 | 第64页 |
| 4.3.6.5 CdnB酶活性检测 | 第64-65页 |
| 4.4 结果与分析 | 第65-76页 |
| 4.4.1 原核表达体系构建 | 第65-68页 |
| 4.4.2 目的蛋白诱导表达条件优化 | 第68-72页 |
| 4.4.3 表达蛋白活性检测 | 第72-76页 |
| 4.5 本章小结 | 第76-77页 |
| 第五章 结论与展望 | 第77-78页 |
| 参考文献 | 第78-81页 |
| 致谢 | 第81-82页 |
| 附录A 基因cdnB序列全长 | 第82-83页 |
| 附录B 基因cdnD序列全长 | 第83-84页 |
