| 致谢 | 第4-10页 |
| 摘要 | 第10-11页 |
| 英文缩写表 | 第11-12页 |
| 1 文献综述 | 第12-18页 |
| 1.1 果胶 | 第12-13页 |
| 1.1.1 果胶组成 | 第12页 |
| 1.1.2 果胶作用 | 第12-13页 |
| 1.2 果胶裂解酶 | 第13-17页 |
| 1.2.1 果胶酶的分类 | 第13页 |
| 1.2.2 果胶酶研究状况 | 第13-15页 |
| 1.2.3 果胶裂解酶 | 第15页 |
| 1.2.4 果胶裂解酶的用途 | 第15-17页 |
| 1.2.4.1 在果汁生产中的应用 | 第15-16页 |
| 1.2.4.2 在纺织业中的应用 | 第16页 |
| 1.2.4.3 在造纸业中的应用 | 第16页 |
| 1.2.4.4 在废水中的应用 | 第16-17页 |
| 1.2.4.5 在饲料中的应用 | 第17页 |
| 1.2.4.6 果胶低聚糖的生产 | 第17页 |
| 1.3 巴斯德毕赤酵母表达系统 | 第17-18页 |
| 2 引言 | 第18-19页 |
| 3 材料与方法 | 第19-37页 |
| 3.1 实验材料 | 第19-21页 |
| 3.1.1 菌种与载体 | 第19页 |
| 3.1.2 酶和实验试剂 | 第19页 |
| 3.1.3 实验仪器 | 第19-20页 |
| 3.1.4 培养基及相关溶液配制 | 第20页 |
| 3.1.5 引物合成 | 第20-21页 |
| 3.2 实验方法 | 第21-37页 |
| 3.2.1 扩增ZJ5中PF00544家族的果胶酶基因 | 第21-23页 |
| 3.2.1.1 ZJ5基因组的提取 | 第21页 |
| 3.2.1.2 ZJ5菌株18S rDNA序列引物的设计 | 第21页 |
| 3.2.1.3 ZJ5菌株18S rDNA序列的扩增 | 第21-22页 |
| 3.2.1.4 扩增ZJ5中PF00544家族的果胶酶保守区序列 | 第22-23页 |
| 3.2.2 扩增各个果胶裂解酶基因全长引物的设计 | 第23-24页 |
| 3.2.3 果胶裂解酶引物的验证 | 第24-25页 |
| 3.2.3.1 果胶裂解酶基因片段的克隆 | 第24页 |
| 3.2.3.2 扩增片段的回收、连接转化和测序 | 第24-25页 |
| 3.2.4 果胶裂解酶基因荧光定量PCR的引物设计 | 第25-26页 |
| 3.2.5 cDNA的合成 | 第26-27页 |
| 3.2.5.1 ZJ5的总RNA提取 | 第26页 |
| 3.2.5.2 反转录获得各个果胶裂解酶cDNA | 第26-27页 |
| 3.2.6 黑曲霉ZJ5中各个果胶裂解酶在不同诱导时间内的表达分析 | 第27页 |
| 3.2.7 菌株黑曲霉ZJ5对果胶的降解 | 第27页 |
| 3.2.8 果胶裂解酶基因pnl-zj5a和pnl-zj5b cDNA全长序列的扩增 | 第27-29页 |
| 3.2.8.1 果胶裂解酶基因pnl-zj5a和pnl-zj5b cDNA全长序列引物的设计 | 第27-28页 |
| 3.2.8.2 果胶裂解酶基因pnl-zj5a和pnl-zj5b cDNA全长的扩增 | 第28页 |
| 3.2.8.3 果胶裂解酶pnl-zj5a和pnl-zj5b的cDNA基因序列分析 | 第28-29页 |
| 3.2.9 重组真核表达质粒pPIC9-pnl-zj5a和pPIC9-pnl-zj5b的构建 | 第29-30页 |
| 3.2.9.1 目的基因与表达载体的连接 | 第29-30页 |
| 3.2.9.2 重组质粒pPIC9-pnl-zj5a和pPIC9-pnl-zj5b的转化 | 第30页 |
| 3.2.10 重组蛋白PNL-ZJ5A和PNL-ZJ5B在毕赤酵母细胞中的表达 | 第30-32页 |
| 3.2.10.1 毕赤酵母感受态细胞的制备 | 第30-31页 |
| 3.2.10.2 酵母转化 | 第31页 |
| 3.2.10.3 产重组酶PNL-ZJ5A和PNL-ZJ5B的毕赤酵母的初筛 | 第31页 |
| 3.2.10.4 产重组酶PNL-ZJ5A和PNL-ZJ5B的毕赤酵母的复筛 | 第31-32页 |
| 3.2.11 发酵罐重组酶的表达 | 第32页 |
| 3.2.12 重组酶蛋白纯化 | 第32页 |
| 3.2.13 蛋白浓度的测定 | 第32-33页 |
| 3.2.14 重组酶蛋白酶学性质的分析 | 第33-35页 |
| 3.2.14.1 果胶裂解酶酶活的测定方法 | 第33-34页 |
| 3.2.14.2 重组酶最适pH和pH稳定性的测定 | 第34页 |
| 3.2.14.3 重组酶最适温度和热稳定的测定 | 第34页 |
| 3.2.14.4 重组酶底物特异性的测定 | 第34页 |
| 3.2.14.5 不同金属离子和相关化学试剂对重组酶活性的影响 | 第34-35页 |
| 3.2.14.6 重组酶比活的测定 | 第35页 |
| 3.2.14.7 重组酶动力学参数测定 | 第35页 |
| 3.2.15 重组酶应用效果评估 | 第35-37页 |
| 3.2.15.1 PNL-ZJ5A在苹果汁中的应用 | 第35-36页 |
| 3.2.15.2 PNL-ZJ5B在苹果汁中的应用 | 第36-37页 |
| 4 结果与分析 | 第37-59页 |
| 4.1 菌株ZJ5中PF00544家族果胶酶保守序列的扩增 | 第37-38页 |
| 4.1.1 ZJ5菌株18S rDNA的扩增 | 第37页 |
| 4.1.2 PF00544家族果胶酶保守序列的扩增 | 第37-38页 |
| 4.2 实时定量PCR(qPCR)检测黑曲霉ZJ5中果胶裂解酶表达情况 | 第38-41页 |
| 4.2.1 果胶裂解酶基因序列分析 | 第38-39页 |
| 4.2.2 qPCR检测黑曲霉ZJ5中果胶裂解酶基因表达 | 第39-40页 |
| 4.2.2.1 总RNA质量检测 | 第39页 |
| 4.2.2.2 黑曲霉ZJ5中果胶裂解酶基因表达的qPCR检测 | 第39-40页 |
| 4.2.3 果胶水解效价评比 | 第40-41页 |
| 4.3 果胶裂解酶PNL-ZJ5A在毕赤酵母酵母中的表达 | 第41-50页 |
| 4.3.1 果胶裂解酶cDNA的获取 | 第41页 |
| 4.3.2 果胶裂解酶cDNA序列分析 | 第41-42页 |
| 4.3.3 果胶裂解酶cDNA重组质粒的验证 | 第42-43页 |
| 4.3.4 果胶裂解酶基因pnl-zj5a在毕赤酵母系统中的表达 | 第43页 |
| 4.3.5 重组酶PNL-ZJ5A的纯化 | 第43-44页 |
| 4.3.6 PNL-ZJ5A酶学性质分析 | 第44-49页 |
| 4.3.6.1 重组酶PNL-ZJ5A反应最适pH和pH稳定性的测定 | 第44页 |
| 4.3.6.2 重组酶PNL-ZJ5A反应最适温度和热稳定性的测定 | 第44-45页 |
| 4.3.6.3 重组酶PNL-ZJ5A底物特异性的测定 | 第45-46页 |
| 4.3.6.4 不同金属离子与化学试剂对重组酶PNL-ZJ5A活性的影响 | 第46-48页 |
| 4.3.6.5 重组酶PNL-ZJ5A K_m值和V_(max)的测定 | 第48-49页 |
| 4.3.7 重组酶PNL-ZJ5A在果汁澄清中的应用 | 第49-50页 |
| 4.4 黑曲霉pnl-zj5b果胶裂解酶的研究 | 第50-59页 |
| 4.4.1 果胶裂解酶pnl-zj5b cDNA的获取 | 第50页 |
| 4.4.2 果胶裂解酶pnl-zj5b cDNA序列分析 | 第50-51页 |
| 4.4.3 果胶裂解酶cDNA重组质粒的验证 | 第51页 |
| 4.4.4 果胶裂解酶基因pnl-zj5b在毕赤酵母系统中的表达 | 第51-52页 |
| 4.4.5 重组蛋白PNL-ZJ5B的纯化 | 第52-53页 |
| 4.4.6 重组酶PNL-ZJ5B酶学性质分析 | 第53-58页 |
| 4.4.6.1 重组酶PNL-ZJ5B反应最适pH和pH稳定性的测定 | 第53-54页 |
| 4.4.6.2 重组酶PNL-ZJ5B反应最适温度和热稳定性的测定 | 第54页 |
| 4.4.6.3 重组酶PNL-ZJ5B底物特异性的测定 | 第54-55页 |
| 4.4.6.4 不同金属离子与化学试剂对重组酶PNL-ZJ5B活性的影响 | 第55-57页 |
| 4.4.6.5 重组酶PNL-ZJ5B K_m值和V_(max)的测定 | 第57-58页 |
| 4.4.7 重组酶在果汁澄清中的应用 | 第58-59页 |
| 5 结论与讨论 | 第59-62页 |
| 5.1 结论 | 第59-60页 |
| 5.2 讨论 | 第60-62页 |
| 6 参考文献 | 第62-69页 |
| ABSTRACT | 第69-70页 |
