| 致谢 | 第5-7页 |
| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 1 文献综述 | 第15-28页 |
| 1.1 植酸及植酸酶概述 | 第15-19页 |
| 1.1.1 植酸简介 | 第15页 |
| 1.1.2 植酸酶的应用及来源 | 第15-16页 |
| 1.1.3 植酸酶分类 | 第16-18页 |
| 1.1.4 植酸酶的酶活检测方法 | 第18-19页 |
| 1.2 植酸酶改性策略 | 第19-23页 |
| 1.2.1 理性设计 | 第20-21页 |
| 1.2.1.1 定点突变 | 第20页 |
| 1.2.1.2 同源比对策略—同序概念(consensus concept) | 第20-21页 |
| 1.2.2 非理性设计—定向进化 | 第21-23页 |
| 1.2.2.1 突变体文库的构建方法 | 第21-22页 |
| 1.2.2.2 高通量筛选方法 | 第22-23页 |
| 1.3 不同宿主菌之间的比较 | 第23-26页 |
| 1.3.1 大肠杆菌 | 第23-24页 |
| 1.3.2 毕赤酵母 | 第24-25页 |
| 1.3.3 枯草芽孢杆菌 | 第25-26页 |
| 1.4 课题研究的内容、目的及意义 | 第26-28页 |
| 2 碱性植酸酶在大肠杆菌中的表达及活性检测 | 第28-43页 |
| 2.1 材料方法 | 第29-37页 |
| 2.1.1 材料 | 第29页 |
| 2.1.2 实验方法 | 第29-37页 |
| 2.1.2.1 重组质粒的构建 | 第29-31页 |
| 2.1.2.2 大肠杆菌BL21感受态制备方法及重组质粒的转化 | 第31页 |
| 2.1.2.3 重组子的鉴定 | 第31-32页 |
| 2.1.2.4 重组菌的诱导表达 | 第32-33页 |
| 2.1.2.5 SDS-PAGE蛋白表达检测 | 第33-35页 |
| 2.1.2.6 蛋白亲和层析法纯化 | 第35-36页 |
| 2.1.2.7 Bradford法测定蛋白浓度 | 第36-37页 |
| 2.1.2.8 植酸酶酶活检测 | 第37页 |
| 2.2 结果 | 第37-42页 |
| 2.2.1 目的基因的PCR扩增 | 第37-38页 |
| 2.2.2 重组质粒的构建及鉴定 | 第38-39页 |
| 2.2.3 值酸酶的诱导表达 | 第39-40页 |
| 2.2.4 蛋白浓度的标准曲线 | 第40页 |
| 2.2.5 植酸酶的酶活检测 | 第40-42页 |
| 2.3 讨论 | 第42-43页 |
| 3 碱性植酸酶在大肠杆菌中的定向进化 | 第43-66页 |
| 3.1 材料方法 | 第43-52页 |
| 3.1.1 材料 | 第43-44页 |
| 3.1.2 实验方法 | 第44-52页 |
| 3.1.2.1 易错PCR及突变体文库构建 | 第44页 |
| 3.1.2.2 突变体诱导表达 | 第44-45页 |
| 3.1.2.3 高通量筛选方法 | 第45-46页 |
| 3.1.2.4 组合突变及饱和突变 | 第46-49页 |
| 3.1.2.5 突变体酶学性质研究 | 第49-51页 |
| 3.1.2.6 同源建模与分子对接 | 第51-52页 |
| 3.2 结果 | 第52-61页 |
| 3.2.1 定向进化 | 第52-54页 |
| 3.2.1.1 易错PCR条件确定 | 第52页 |
| 3.2.1.2 进化结果 | 第52-54页 |
| 3.2.2 突变体酶学性质 | 第54-58页 |
| 3.2.2.1 温度曲线 | 第54-55页 |
| 3.2.2.2 pH曲线 | 第55页 |
| 3.2.2.3 温度稳定性 | 第55-56页 |
| 3.2.2.4 pH稳定性 | 第56-57页 |
| 3.2.2.5 动力学参数 | 第57-58页 |
| 3.2.3 同源建模及分子对接 | 第58-61页 |
| 3.3 讨论 | 第61-66页 |
| 4 定向进化获得的突变体在毕赤酵母GS115中的表达及酶学性质研究 | 第66-79页 |
| 4.1 材料方法 | 第66-71页 |
| 4.1.1 材料 | 第66页 |
| 4.1.2 实验方法 | 第66-71页 |
| 4.1.2.1 碱性植酸酶基因克隆及重组质粒构建 | 第66-67页 |
| 4.1.2.2 重组质粒线性化 | 第67页 |
| 4.1.2.3 毕赤酵母GS115感受态制备 | 第67-68页 |
| 4.1.2.4 线性化质粒转化 | 第68-69页 |
| 4.1.2.5 重组子鉴定 | 第69页 |
| 4.1.2.6 重组酵母诱导表达 | 第69-70页 |
| 4.1.2.7 酵母表达的植酸酶的去糖基化 | 第70-71页 |
| 4.2 结果 | 第71-77页 |
| 4.2.1 重组酵母的构建及基因鉴定 | 第71-72页 |
| 4.2.2 重组酵母诱导表达 | 第72页 |
| 4.2.3 酶活检测 | 第72-74页 |
| 4.2.4 温度曲线 | 第74-75页 |
| 4.2.5 pH曲线 | 第75-76页 |
| 4.2.6 热稳定性 | 第76页 |
| 4.2.7 pH稳定性 | 第76-77页 |
| 4.3 讨论 | 第77-79页 |
| 5 定向进化获得的突变体在枯草芽孢杆菌WB800N中的表达及酶学性质研究 | 第79-89页 |
| 5.1 材料方法 | 第79-82页 |
| 5.1.1 材料 | 第79-80页 |
| 5.1.2 实验方法 | 第80-82页 |
| 5.1.2.1 植酸酶基因的克隆及重组质粒构建 | 第80页 |
| 5.1.2.2 枯草芽孢杆菌WB800N感受态制备方法 | 第80-81页 |
| 5.1.2.3 重组质粒转化 | 第81-82页 |
| 5.1.2.4 重组枯草芽孢杆菌诱导表达 | 第82页 |
| 5.2 结果 | 第82-88页 |
| 5.2.1 重组枯草芽孢杆菌的构建 | 第82-83页 |
| 5.2.2 重组枯草芽孢杆菌诱导表达 | 第83-84页 |
| 5.2.3 酶活检测 | 第84-85页 |
| 5.2.4 温度曲线 | 第85-86页 |
| 5.2.5 pH曲线 | 第86-87页 |
| 5.2.6 温度稳定性 | 第87页 |
| 5.2.7 pH稳定性 | 第87-88页 |
| 5.3 讨论 | 第88-89页 |
| 6 结论与展望 | 第89-91页 |
| 6.1 结论 | 第89-90页 |
| 6.2 展望 | 第90-91页 |
| 参考文献 | 第91-98页 |
| 作者简介 | 第98页 |
