| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 第1章 研究背景 | 第15-36页 |
| 1.1 里氏木霉发展简史 | 第15-17页 |
| 1.2 里氏木霉的诱变及筛选 | 第17-18页 |
| 1.2.1 Natick实验室和在日本开发的突变菌株 | 第17-18页 |
| 1.2.2 罗格斯大学开发的突变菌株 | 第18页 |
| 1.3 系统生物学方法理解里氏木霉纤维素酶的生产 | 第18-22页 |
| 1.3.1 里氏木霉的基因组 | 第18-19页 |
| 1.3.2 CAZymes编码基因在里氏木霉基因组中的分布 | 第19-20页 |
| 1.3.3 基因组重测序鉴定对纤维素酶生产具有潜在影响的基因 | 第20-21页 |
| 1.3.4 里氏木霉转录组分析 | 第21-22页 |
| 1.4 里氏木霉CAZymes的表达调控 | 第22-26页 |
| 1.4.1 里氏木霉分泌的CAZymes | 第22页 |
| 1.4.2 碳源影响纤维素酶和半纤维素酶表达 | 第22-23页 |
| 1.4.3 转录因子调控纤维素酶和半纤维素酶基因表达 | 第23-25页 |
| 1.4.4 转运蛋白参与纤维素酶和半纤维素酶表达 | 第25-26页 |
| 1.5 质膜H~+-ATP酶对胞质pH的调节 | 第26-28页 |
| 1.5.1 Pma的结构、功能及调节 | 第27-28页 |
| 1.5.2 细胞响应pH压力 | 第28页 |
| 1.5.3 pH对里氏木霉纤维素酶和半纤维素酶表达的影响 | 第28页 |
| 1.6 纤维素酶和半纤维素酶在工业上的应用 | 第28-32页 |
| 1.6.1 纤维素酶及其生产菌株的分离 | 第28-29页 |
| 1.6.2 纤维素酶的工业应用 | 第29-31页 |
| 1.6.3 半纤维素酶及其生产菌株的分离 | 第31页 |
| 1.6.4 半纤维素酶的工业应用 | 第31-32页 |
| 1.7 利用宏基因组手段挖掘新型糖苷水解酶基因 | 第32-33页 |
| 1.7.1 目标基因富集的策略 | 第32页 |
| 1.7.2 利用宏基因组挖掘新酶的策略 | 第32-33页 |
| 1.8 本文研究内容及意义 | 第33-36页 |
| 1.8.1 研究内容 | 第33-35页 |
| 1.8.2 研究意义 | 第35-36页 |
| 第2章 重测序和转录组分析里氏木霉纤维素酶高产菌株 | 第36-100页 |
| 2.1 引言 | 第36页 |
| 2.2 材料 | 第36-50页 |
| 2.2.1 菌株与质粒 | 第36-37页 |
| 2.2.2 引物序列 | 第37-42页 |
| 2.2.3 主要试剂和耗材 | 第42-43页 |
| 2.2.4 常用试剂配制 | 第43-45页 |
| 2.2.5 主要培养基配制 | 第45-48页 |
| 2.2.6 主要仪器和设备 | 第48-49页 |
| 2.2.7 实验所用程序及软件 | 第49-50页 |
| 2.3 实验方法 | 第50-64页 |
| 2.3.1 PCR | 第50-52页 |
| 2.3.2 DNA凝胶电泳 | 第52页 |
| 2.3.3 胶回收DNA片段 | 第52-53页 |
| 2.3.4 DNA片段与载体快速连接 | 第53页 |
| 2.3.5 质粒小量提取 | 第53页 |
| 2.3.6 酶切体系及条件 | 第53-54页 |
| 2.3.7 载体与DNA片段连接 | 第54页 |
| 2.3.8 质粒转化 | 第54页 |
| 2.3.9 根瘤农杆菌感受态细胞的制备 | 第54-55页 |
| 2.3.10 电转 | 第55页 |
| 2.3.11 结合转移 | 第55-56页 |
| 2.3.12 孢子扩培、收集和保存 | 第56页 |
| 2.3.13 里氏木霉转化子筛选和鉴定 | 第56页 |
| 2.3 14 基因组提取 | 第56-57页 |
| 2.3.15 RNA提取 | 第57页 |
| 2.3.16 cDNA合成和qPCR | 第57-58页 |
| 2.3.17 标准曲线的制作 | 第58-59页 |
| 2.3.18 纤维素内切酶活力的测定 | 第59页 |
| 2.3.19 滤纸酶活的测定 | 第59-60页 |
| 2.3.20 纤维素外切酶活力的测定 | 第60页 |
| 2.3.21 蛋白表达及纯化 | 第60页 |
| 2.3.22 脱氢酶活性检测 | 第60-61页 |
| 2.3.23 里氏木霉菌株生长检测 | 第61页 |
| 2.3.24 蛋白浓度检测 | 第61页 |
| 2.3.25 基因组重测序及数据处理 | 第61-62页 |
| 2.3.26 转录组测序及数据处理 | 第62页 |
| 2.3.27 SNPs和indels位点验证 | 第62页 |
| 2.3.28 统计学分析 | 第62-63页 |
| 2.3.29 质粒构建 | 第63-64页 |
| 2.4 实验结果与讨论 | 第64-98页 |
| 2.4.1 高产菌株SS-Ⅱ和RUT-C30表型分析 | 第64-66页 |
| 2.4.2 菌株SS-Ⅱ和RUT-C30在四种碳源下的转录组数据比较分析 | 第66-71页 |
| 2.4.3 纤维素降解相关基因在SS-Ⅱ和RUT-C30中差异表达分析 | 第71-73页 |
| 2.4.4 转录调控因子差异表达分析及人工光控转录因子的构建 | 第73-76页 |
| 2.4.5 转运体在SS-Ⅱ和RUT-C30中差异表达分析 | 第76-80页 |
| 2.4.6 菌株SS-Ⅱ基因组重测序数据分析 | 第80-87页 |
| 2.4.7 菌株SS-Ⅱ碱基突变模式分析 | 第87页 |
| 2.4.8 受突变影响的基因GO功能分类 | 第87-89页 |
| 2.4.9 候选基因用于敲除分析 | 第89-90页 |
| 2.4.10 敲除菌株纤维素酶活性分析 | 第90-91页 |
| 2.4.11 敲除菌株△56839和△112034纤维素酶编码基因转录水平分析 | 第91-93页 |
| 2.4.12 基因tre56839和tre112034的功能分析 | 第93-98页 |
| 2.5 本章小结 | 第98-100页 |
| 第3章 里氏木霉质膜H~+-ATP酶的鉴定及其敲除对菌株影响的分析 | 第100-133页 |
| 3.1 引言 | 第100页 |
| 3.2 材料 | 第100-104页 |
| 3.2.1 菌株与质粒 | 第100-101页 |
| 3.2.2 引物序列 | 第101-103页 |
| 3.2.3 主要试剂和耗材 | 第103页 |
| 3.2.4 常用试剂及培养基的配制 | 第103-104页 |
| 3.2.5 主要仪器和设备 | 第104页 |
| 3.2.6 所用程序及软件 | 第104页 |
| 3.3 实验方法 | 第104-113页 |
| 3.3.1 敲除菌株的构建 | 第104页 |
| 3.3.2 生物信息分析及系统进化分析 | 第104页 |
| 3.3.3 菌株培养及RNA提取 | 第104-105页 |
| 3.3.4 cDNA合成及qPCR分析 | 第105页 |
| 3.3.5 酶活性分析 | 第105页 |
| 3.3.6 胞内外pH检测 | 第105页 |
| 3.3.7 生物质干重和葡萄糖残量检测 | 第105页 |
| 3.3.8 细胞核蛋白提取 | 第105-106页 |
| 3.3.9 改良型Lowry法测量细胞核蛋白浓度 | 第106页 |
| 3.3.10 制备生物素标记的探针 | 第106-109页 |
| 3.3.11 电泳迁移率检测(EMSA) | 第109-111页 |
| 3.3.12 链亲和素亲和层析分离与探针结合的蛋白 | 第111-112页 |
| 3.3.13 筛选标记的缺失及验证 | 第112-113页 |
| 3.4 实验结果与讨论 | 第113-131页 |
| 3.4.1 基因tre76238和tre78757的鉴定 | 第113-115页 |
| 3.4.2 基因tre76238的敲除对菌株纤维素酶生产的影响 | 第115-117页 |
| 3.4.3 敲除菌株Del238表型分析 | 第117-119页 |
| 3.4.4 敲除基因tre76238影响菌株将质子泵出到胞外 | 第119-121页 |
| 3.4.5 敲除基因tre78757不影响菌株纤维素酶生产 | 第121页 |
| 3.4.6 敲除基因tre78757不影响菌株将质子泵出到胞外 | 第121-122页 |
| 3.4.7 基因tre76238和tre78757双敲除彻底损害菌株生长 | 第122-123页 |
| 3.4.8 菌株Del238中纤维素酶合成相关的基因的转录分析 | 第123-125页 |
| 3.4.9 EMSA分析cbh1启动子区域 | 第125-126页 |
| 3.4.10 与cbh1启动子片段结合的蛋白的分离及鉴定 | 第126-131页 |
| 3.5 本章小结 | 第131-133页 |
| 第4章 宏基因组分析棉花降解微生物群及挖掘新型糖苷水解酶 | 第133-157页 |
| 4.1 引言 | 第133页 |
| 4.2 材料 | 第133-137页 |
| 4.2.1 土壤样品 | 第133页 |
| 4.2.2 菌株与质粒 | 第133-134页 |
| 4.2.3 引物序列 | 第134-135页 |
| 4.2.4 主要试剂和耗材 | 第135-136页 |
| 4.2.5 常用试剂配制 | 第136页 |
| 4.2.6 主要培养基配制 | 第136页 |
| 4.2.7 主要仪器和设备 | 第136页 |
| 4.2.8 实验所用软件及工具 | 第136-137页 |
| 4.3 实验方法 | 第137-142页 |
| 4.3.1 土壤采样及加工 | 第137页 |
| 4.3.2 样品微生物富集 | 第137页 |
| 4.3.3 宏基因组DNA抽提 | 第137页 |
| 4.3.4 MiSeq测序和16S数据分析 | 第137-138页 |
| 4.3.5 HiSeq测序及数据分析 | 第138-139页 |
| 4.3.6 候选基因克隆和表达 | 第139-140页 |
| 4.3.7 标准曲线的绘制 | 第140页 |
| 4.3.8 糖苷水解酶活力的测定 | 第140-141页 |
| 4.3.9 酶最适反应温度的测定 | 第141-142页 |
| 4.4 实验结果与讨论 | 第142-155页 |
| 4.4.1 棉花生物质降解 | 第142页 |
| 4.4.2 棉花降解过程中酶的组分分析 | 第142-144页 |
| 4.4.3 土壤微生物群落组成分析 | 第144-145页 |
| 4.4.4 宏基因组序列分析 | 第145-146页 |
| 4.4.5 宏基因组序列功能分析 | 第146-147页 |
| 4.4.6 糖苷水解酶编码基因的挖掘 | 第147-150页 |
| 4.4.7 候选糖苷水解酶编码基因的克隆和表达 | 第150页 |
| 4.4.8 候选糖苷水解酶活性表征 | 第150-155页 |
| 4.5 本章小结 | 第155-157页 |
| 第5章 研究总结及展望 | 第157-160页 |
| 5.1 总结 | 第157-159页 |
| 5.2 展望 | 第159-160页 |
| 参考文献 | 第160-174页 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 | 第174-175页 |
| 致谢 | 第175页 |
