| 摘要 | 第6-7页 |
| Abstract | 第7页 |
| 第一章 引言 | 第13-25页 |
| 1.1 痘病毒毒力基因及免疫逃避机制 | 第13-18页 |
| 1.1.1 K3L蛋白家族 | 第13页 |
| 1.1.2 K1L和C7L蛋白家族 | 第13-15页 |
| 1.1.3 B5R蛋白家族 | 第15-16页 |
| 1.1.4 SPI蛋白家族 | 第16-17页 |
| 1.1.5 E3L蛋白家族 | 第17-18页 |
| 1.2 IFN信号通路研究进展 | 第18-21页 |
| 1.2.1 IFN类型 | 第18页 |
| 1.2.2 IFN信号通路 | 第18-21页 |
| 1.3 基因编辑技术 | 第21-24页 |
| 1.3.1 Crispr/Cas9系统的介绍 | 第21-22页 |
| 1.3.2 Crispr/Cas9技术的应用 | 第22-24页 |
| 1.4 研究目的及展望 | 第24-25页 |
| 第二章 SPPV TaqMan-MGB荧光定量PCR快速检测方法的建立 | 第25-33页 |
| 2.1 试验材料 | 第25页 |
| 2.1.1 病毒株与细胞 | 第25页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第25页 |
| 2.1.3 主要仪器 | 第25页 |
| 2.2 试验方法 | 第25-27页 |
| 2.2.1 引物和探针的设计与合成 | 第25-26页 |
| 2.2.2 重组质粒标准品的制备 | 第26页 |
| 2.2.3 荧光定量PCR反应条件的优化 | 第26页 |
| 2.2.4 荧光定量PCR反应标准曲线的绘制 | 第26页 |
| 2.2.5 特异性检测 | 第26页 |
| 2.2.6 敏感性检测 | 第26-27页 |
| 2.2.7 重复性检测 | 第27页 |
| 2.2.8 临床样品检测试验 | 第27页 |
| 2.3 试验结果 | 第27-31页 |
| 2.3.1 重组质粒标准品的制备 | 第27-28页 |
| 2.3.2 反应体系的优化 | 第28页 |
| 2.3.3 SPPV qPCR检测方法的建立 | 第28页 |
| 2.3.4 SPPV qPCR检测方法特异性检测结果 | 第28-29页 |
| 2.3.5 SPPV qPCR检测方法敏感性检测结果 | 第29-30页 |
| 2.3.6 重复性试验结果 | 第30-31页 |
| 2.3.7 SPPV TaqMan-MGB探针荧光定量检测临床样本 | 第31页 |
| 2.4 讨论 | 第31-33页 |
| 第三章 SPPV感染Hela细胞对PKR-eIF2α信号通路的影响 | 第33-38页 |
| 3.1 试验材料 | 第33页 |
| 3.1.1 毒株和细胞 | 第33页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第33页 |
| 3.1.3 仪器设备 | 第33页 |
| 3.2 试验方法 | 第33-35页 |
| 3.2.1 细胞的复苏与培养 | 第33-34页 |
| 3.2.2 SPPV TCID_(50)的测定 | 第34页 |
| 3.2.3 SPPV增殖曲线的测定 | 第34页 |
| 3.2.4 PKR和eIF2α活化与病毒接种时间的关系 | 第34-35页 |
| 3.3 试验结果 | 第35-36页 |
| 3.3.1 SPPV TCID_(50)的测定 | 第35页 |
| 3.3.2 SPPV增殖曲线的测定 | 第35页 |
| 3.3.3 PKR和eIF2α活化与病毒接种时间呈时间依赖性关系 | 第35-36页 |
| 3.4 讨论 | 第36-38页 |
| 第四章 E3L蛋白与PKR的互作研究 | 第38-52页 |
| 4.1 试验材料 | 第38页 |
| 4.1.1 主要试剂 | 第38页 |
| 4.1.2 主要仪器 | 第38页 |
| 4.2 试验方法 | 第38-42页 |
| 4.2.1 SPPV-E3L蛋白的表达水平检测 | 第38-39页 |
| 4.2.2 E3L及其同源基因真核表达载体的构建 | 第39-40页 |
| 4.2.3 E3L及其同源基因的真核表达及检测 | 第40-41页 |
| 4.2.4 E3L 及其同源蛋白在 Hela 细胞内与 PKR 的物理相互关系 | 第41页 |
| 4.2.5 E3L及其同源蛋白对Hela细胞内PKR磷酸化的影响 | 第41页 |
| 4.2.6 VACV-E3L蛋白的表达对SPPV的复制的影响 | 第41-42页 |
| 4.3 试验结果 | 第42-50页 |
| 4.3.1 SPPV-E3L蛋白的表达曲线 | 第42页 |
| 4.3.2 E3L及其同源基因真核表达载体的构建 | 第42-47页 |
| 4.3.3 E3L及其同源基因的真核表达及检测 | 第47页 |
| 4.3.4 E3L及其同源蛋白与PKR的物理相互关系 | 第47-48页 |
| 4.3.5 瞬时表达E3L及其同源蛋白对细胞内PKR磷酸化的影响 | 第48-49页 |
| 4.3.6 VACV-E3L蛋白的表达对SPPV的复制的影响 | 第49-50页 |
| 4.4 讨论 | 第50-52页 |
| 第五章 人源PKR基因敲除Hela细胞株的构建 | 第52-59页 |
| 5.1 试验材料 | 第52页 |
| 5.1.1 主要试剂 | 第52页 |
| 5.1.2 主要仪器 | 第52页 |
| 5.2 试验方法 | 第52-54页 |
| 5.2.1 PKR靶点设计与合成 | 第52-53页 |
| 5.2.2 pHMG-sgRNA载体的构建 | 第53页 |
| 5.2.3 sgRNA在Hela细胞中的效率筛选 | 第53-54页 |
| 5.2.4 单细胞克隆的制备 | 第54页 |
| 5.3 试验结果 | 第54-57页 |
| 5.3.1 PKR靶点设计与合成 | 第54页 |
| 5.3.2 pHMG-sgRNA载体的鉴定 | 第54-55页 |
| 5.3.3 sgRNA在Hela细胞中的打靶效率筛选 | 第55-57页 |
| 5.3.4 PKR基因敲出Hela细胞株的鉴定 | 第57页 |
| 5.4 讨论 | 第57-59页 |
| 第六章 全文总结 | 第59-60页 |
| 参考文献 | 第60-67页 |
| 附录 | 第67-69页 |
| 致谢 | 第69-70页 |
| 作者简历 | 第70页 |
