| 摘要 | 第8-10页 |
| ABSTRACT | 第10-11页 |
| 缩略词表 | 第12-13页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-24页 |
| 1.1 新现猪DELTA冠状病毒（PDCOV）病原学 | 第13-18页 |
| 1.1.1 PDCoV形态结构 | 第13-14页 |
| 1.1.2 PDCoV培养特性 | 第14页 |
| 1.1.3 PDCoV抗原性 | 第14页 |
| 1.1.4 PDCoV基因组结构特征 | 第14-17页 |
| 1.1.5 PDCoV的复制 | 第17-18页 |
| 1.2 PDCOV的流行病学 | 第18-20页 |
| 1.3 PDCOV致病性 | 第20-21页 |
| 1.4 PDCOV检测方法的研究进展 | 第21-23页 |
| 1.4.1 PDCoV核酸分子生物学检测方法 | 第21-22页 |
| 1.4.2 血清学诊断方法 | 第22页 |
| 1.4.3 病理组织学诊断 | 第22-23页 |
| 1.5 立题依据和研究目标 | 第23-24页 |
| 1.5.1 立题依据 | 第23页 |
| 1.5.2 研究目标 | 第23-24页 |
| 第二章 新现猪DELTA冠状病毒RT-PCR检测方法的建立及其应用 | 第24-31页 |
| 2.1 材料与方法 | 第24-26页 |
| 2.1.1 病料及主要试剂 | 第24-25页 |
| 2.1.2 引物设计 | 第25页 |
| 2.1.3 病毒核酸的提取 | 第25页 |
| 2.1.4 反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）及测序 | 第25页 |
| 2.1.5 核苷酸同源性比对及进化树分析 | 第25-26页 |
| 2.1.6 RT-PCR特异性试验 | 第26页 |
| 2.1.7 RT-PCR敏感性试验 | 第26页 |
| 2.1.8 临床腹泻样品的检测 | 第26页 |
| 2.2 结果 | 第26-30页 |
| 2.2.1 PDCoV RT-PCR电泳结果 | 第26-27页 |
| 2.2.2 不同国家/地区PDCoV毒株部分N基因核苷酸同源性及进化树分析 | 第27页 |
| 2.2.3 RT-PCR特异性试验 | 第27-29页 |
| 2.2.4 RT-PCR敏感性试验 | 第29页 |
| 2.2.5 临床腹泻样品的检测 | 第29-30页 |
| 2.3 讨论 | 第30-31页 |
| 第三章 猪DELTA冠状病毒RT-LAMP方法的建立 | 第31-40页 |
| 3.1 材料 | 第32页 |
| 3.1.1 病毒样品和临床病料 | 第32页 |
| 3.1.2 主要生化试剂 | 第32页 |
| 3.1.3 主要仪器 | 第32页 |
| 3.2 方法 | 第32-35页 |
| 3.2.1 引物与合成 | 第32-33页 |
| 3.2.2 RNA的提取 | 第33页 |
| 3.2.3 病毒标准阳性质粒的制备 | 第33页 |
| 3.2.4 RT-LAMP检测方法的建立 | 第33-34页 |
| 3.2.5 RT-LAMP敏感性试验 | 第34页 |
| 3.2.6 RT-LAMP特异性试验 | 第34页 |
| 3.2.8 RT-LAMP重复性试验 | 第34-35页 |
| 3.2.9 对临床样品的检测 | 第35页 |
| 3.3 结果 | 第35-39页 |
| 3.3.1 RT-LAMP引物的优化选择 | 第35页 |
| 3.3.2 RT-LAMP反应体系优化 | 第35-36页 |
| 3.3.3 RT-LAMP反应的可视化 | 第36页 |
| 3.3.4 RT-LAMP反应条件优化 | 第36页 |
| 3.3.5 RT-LAMP敏感性试验 | 第36-37页 |
| 3.3.6 RT-LAMP特异性试验 | 第37-38页 |
| 3.3.7 临床腹泻样品的检测 | 第38-39页 |
| 3.4 讨论 | 第39-40页 |
| 第四章 猪DELTA冠状病毒N基因序列分析 | 第40-52页 |
| 4.1 材料 | 第40-41页 |
| 4.1.1 临床样品和载体 | 第40页 |
| 4.1.2 主要生化试剂 | 第40-41页 |
| 4.1.3 主要仪器 | 第41页 |
| 4.1.4 常用试剂、培养基的配制 | 第41页 |
| 4.2 方法 | 第41-44页 |
| 4.2.1 总RNA的提取 | 第41页 |
| 4.2.2 PDCo V N全基因扩增引物设计 | 第41-42页 |
| 4.2.3 PDCo V N全基因序列的扩增及测序 | 第42-44页 |
| 4.2.4 PDCo V N编码蛋白质结构与功能预测 | 第44页 |
| 4.3 结果 | 第44-50页 |
| 4.3.1 PDCoV N基因的克隆 | 第44-45页 |
| 4.3.2 重组克隆质粒菌液PCR鉴定与测序结果 | 第45页 |
| 4.3.3 PDCoV N基因生物信息学分析 | 第45-49页 |
| 4.3.4 PDCoV-N编码蛋白质结构和功能分析 | 第49-50页 |
| 4.4 讨论 | 第50-52页 |
| 第五章 PDCOV N基因全长的可溶性原核表达 | 第52-67页 |
| 5.1 材料和方法 | 第52-55页 |
| 5.1.2 主要生化试剂 | 第52-53页 |
| 5.1.3 主要仪器 | 第53页 |
| 5.1.4 试剂配制 | 第53页 |
| 5.1.5 SDS-PAGE试剂配制 | 第53-54页 |
| 5.1.6 蛋白纯化试剂配制 | 第54-55页 |
| 5.1.7 Western blot试验试剂配制 | 第55页 |
| 5.2 方法 | 第55-60页 |
| 5.2.1 PDCo V N基因原核表达引物设计 | 第55页 |
| 5.2.2 PDCo V N基因的全长序列的扩增 | 第55-56页 |
| 5.2.3 目的产物胶回收 | 第56页 |
| 5.2.4 目的基因克隆 | 第56页 |
| 5.2.5 连接产物的转化 | 第56页 |
| 5.2.6 菌落的挑取及PCR鉴定 | 第56页 |
| 5.2.7 序列测定及分析 | 第56页 |
| 5.2.8 重组克隆质粒的双酶切鉴定 | 第56-57页 |
| 5.2.10 重组表达质粒pcold-PDCoV-N的构建 | 第57页 |
| 5.2.11 重组蛋白的诱导表达 | 第57-59页 |
| 5.2.12 重组蛋白的纯化 | 第59-60页 |
| 5.2.13 重组蛋白浓度的测定 | 第60页 |
| 5.2.14 重组蛋白Western blot分析 | 第60页 |
| 5.3 结果 | 第60-65页 |
| 5.3.1 目的基因的扩增 | 第60-61页 |
| 5.3.2 重组克隆质粒pMD-PDCoV的鉴定 | 第61-62页 |
| 5.3.3 重组表达质粒pcold-PDCoV-N的构建 | 第62页 |
| 5.3.4 重组表达菌液PCR鉴定 | 第62页 |
| 5.3.5 重组蛋白的表达 | 第62-64页 |
| 5.3.6 纯化蛋白的浓度测定 | 第64-65页 |
| 5.3.7 Western blot鉴定 | 第65页 |
| 5.4 讨论 | 第65-67页 |
| 第六章 猪Δ冠状病毒间接ELISA方法的建立 | 第67-77页 |
| 6.1 材料 | 第67-68页 |
| 6.1.1 试验设备 | 第67页 |
| 6.1.2 主要生化试剂及实验材料 | 第67-68页 |
| 6.1.3 主要试剂的配制 | 第68页 |
| 6.2 方法 | 第68-71页 |
| 6.2.1 间接ELISA操作步骤 | 第68-69页 |
| 6.2.2 抗原包被浓度和血清稀释度的确定 | 第69页 |
| 6.2.3 封闭液的确定 | 第69页 |
| 6.2.4 封闭时间的确定 | 第69页 |
| 6.2.5 血清反应时间的确定 | 第69-70页 |
| 6.2.6 酶标二抗稀释度的确定 | 第70页 |
| 6.2.7 酶标二抗反应时间的确定 | 第70页 |
| 6.2.8 底物显色时间的确定 | 第70页 |
| 6.2.9 临界值的确定 | 第70页 |
| 6.2.10 特异性试验 | 第70页 |
| 6.2.11 重复性试验和稳定性试验 | 第70页 |
| 6.2.12 临床样品的检测 | 第70-71页 |
| 6.3 结果 | 第71-76页 |
| 6.3.1 抗原包被浓度及血清稀释倍数的确定 | 第71页 |
| 6.3.2 封闭液的确定 | 第71页 |
| 6.3.3 封闭时间的确定 | 第71页 |
| 6.3.4 血清反应时间的确定 | 第71-73页 |
| 6.3.5 酶标二抗稀释度的确定 | 第73页 |
| 6.3.6 酶标二抗反应时间的确定 | 第73-74页 |
| 6.3.7 显色时间的确定 | 第74-75页 |
| 6.3.8 间接ELISA阴、阳性血清临界值的确定 | 第75页 |
| 6.3.9 特异性试验 | 第75-76页 |
| 6.3.10 重复性试验 | 第76页 |
| 6.3.11 临床血清样品的检测 | 第76页 |
| 6.4 讨论 | 第76-77页 |
| 全文小结 | 第77-78页 |
| 参考文献 | 第78-84页 |
| 致谢 | 第84-85页 |
| 研究生期间发表论文 | 第85页 |
