| 致谢 | 第6-7页 |
| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 缩写表 | 第11-17页 |
| 第一部分 口服家蚕表达的胰岛素和谷氨酸脱羧酶65双抗原防治1型糖尿病研究 | 第17-67页 |
| 1 引言 | 第17-21页 |
| 1.1 1型糖尿病 | 第17-18页 |
| 1.2 口服耐受 | 第18-19页 |
| 1.3 联合免疫疗法 | 第19页 |
| 1.4 本研究的目的与意义 | 第19-21页 |
| 2 实验材料与方法 | 第21-40页 |
| 2.1 实验材料 | 第21-25页 |
| 2.1.1 实验动物 | 第21页 |
| 2.1.2 细胞系 | 第21页 |
| 2.1.3 质粒和细菌 | 第21页 |
| 2.1.4 抗体 | 第21页 |
| 2.1.5 实验耗材与设备 | 第21-22页 |
| 2.1.6 实验试剂 | 第22页 |
| 2.1.7 相关试剂配置 | 第22-25页 |
| 2.2 CTB-Ins-GAD和CTB-GAD-Ins杆状病毒的构建实验方法 | 第25-33页 |
| 2.2.1 CTB-Ins-GAD和CTB-GAD-Ins融合基因的构建 | 第25-28页 |
| 2.2.2 PCR产物凝胶回收 | 第28页 |
| 2.2.3 PCR产物连接PMD19-T载体 | 第28页 |
| 2.2.4 E.coli TG1感受态细胞的制备 | 第28-29页 |
| 2.2.5 连接产物转化大肠杆菌(TG1或DH10) | 第29页 |
| 2.2.6 阳性克隆的扩大培养及质粒抽提 | 第29页 |
| 2.2.7 阳性质粒的酶切鉴定 | 第29-30页 |
| 2.2.8 重组杆状病毒质粒(Bacmid)构建 | 第30-31页 |
| 2.2.9 杆状病毒的获得与鉴定 | 第31-33页 |
| 2.2.9.1 家蚕卵巢细胞培养 | 第31-32页 |
| 2.2.9.2 杆状病毒(CTB-Ins-GAD/CTB-GAD-Ins)的获得 | 第32页 |
| 2.2.9.3 杆状病毒(CTB-Ins-GAD/CTB-GAD-Ins)的扩大培养 | 第32-33页 |
| 2.2.9.4 杆状病毒(CTB-Ins-GAD/CTB-GAD-Ins)感染能力测定 | 第33页 |
| 2.2.9.5 杆状病毒(CTB-Ins-GAD/CTB-GAD-Ins)基因组提取 | 第33页 |
| 2.2.9.6 杆状病毒(CTB-Ins-GAD/CTB-GAD-Ins)PCR鉴定 | 第33页 |
| 2.3 融合蛋白的表达实验方法 | 第33-36页 |
| 2.3.1 融合蛋白在家蚕卵巢细胞中的表达 | 第33-34页 |
| 2.3.2 融合蛋白在蚕蛹中的表达 | 第34页 |
| 2.3.3 Western blot实验方法 | 第34-35页 |
| 2.3.4 ELlSA法测定表达量 | 第35-36页 |
| 2.3.5 GM1-ELISA测定融合蛋白的GM1结合力 | 第36页 |
| 2.4 口服融合蛋白防治T1D实验方法 | 第36-40页 |
| 2.4.1 抗体及抗体亚型滴度检测 | 第36-37页 |
| 2.4.2 胰腺组织切片 | 第37页 |
| 2.4.3 口服CTB-Ins-GAD和CTB-GAD-Ins防治T1D效果检测 | 第37页 |
| 2.4.4 Th1/Th2细胞ELISPOT分析 | 第37-38页 |
| 2.4.5 IL-4/IFN-γ细胞因子浓度检测 | 第38页 |
| 2.4.6 CD4+CD25+Foxp3+T细胞分析 | 第38页 |
| 2.4.7 脾脏淋巴细胞体外增值能力分析 | 第38-39页 |
| 2.4.8 脾脏淋巴细胞体外迁移能力分析 | 第39页 |
| 2.4.9 过继转移实验方法 | 第39-40页 |
| 3 实验结果与分析 | 第40-64页 |
| 3.1 获得CTB-GAD、CTB-Ins、GAD、Ins片段 | 第40页 |
| 3.2 构建CTB-GAD-Ins/CTB-Ins-GAD融合基因 | 第40-41页 |
| 3.3 构建Bacmid(CTB-GAD-Ins/CTB-Ins-GAD)载体 | 第41-45页 |
| 3.3.1 pBac(CTB-GAD-Ins/CTB-Ins-GAD)载体构建和鉴定 | 第41-42页 |
| 3.3.2 重组Bacmid质粒的构建与鉴定 | 第42-43页 |
| 3.3.3 重组杆状病毒的获得及鉴定 | 第43-44页 |
| 3.3.4 BmV-CTB-GAD-Ins和BmV-CTB-Ins-GAD病毒滴度检测 | 第44-45页 |
| 3.4 融合蛋白的表达及鉴定 | 第45-48页 |
| 3.4.1 融合蛋白在家蚕细胞和蚕蛹高效表达 | 第45-46页 |
| 3.4.2 Western Blot分析融合蛋白表达 | 第46-47页 |
| 3.4.3 GM1结合ELISA检测蛋白活性 | 第47-48页 |
| 3.5 口服CTB-GAD-Ins/CTB-Ins-GAD减轻胰岛炎 | 第48-50页 |
| 3.6 口服CTB-GAD-Ins/CTB-Ins-GAD降低糖尿病发病率 | 第50-51页 |
| 3.7 口服CTB-GAD-Ins/CTB-Ins-GAD诱导胰岛素和GAD特异性的Th2型免疫反应 | 第51-53页 |
| 3.8 口服CTB-GAD-Ins/CTB-Ins-GAD诱导Th1向Th2型转化 | 第53-56页 |
| 3.9 口服CTB-GAD-Ins/CTB-Ins-GAD增加调节性T细胞分化 | 第56-58页 |
| 3.10 口服CTB-GAD-Ins/CTB-Ins-GAD抑制脾脏T细胞增殖 | 第58-60页 |
| 3.11 口服CTB-GAD-Ins/CTB-Ins-GAD抑制脾脏T细胞迁移 | 第60-62页 |
| 3.12 口服CTB-GAD-Ins/CTB-Ins-GAD诱导NOD小鼠产生调节性T细胞 | 第62-64页 |
| 4 讨论 | 第64-67页 |
| 第二部分 口服家蚕表达的霍乱病毒B亚基与双拷贝Aβ42融合蛋白防治阿尔茨海默症研究 | 第67-99页 |
| 1 引言 | 第67-71页 |
| 1.1 阿尔茨海默症 | 第67页 |
| 1.2 阿尔茨海默症的治疗 | 第67-69页 |
| 1.2.1 传统疗法 | 第67-68页 |
| 1.2.2 免疫疗法 | 第68-69页 |
| 1.3 本研究的目的意义 | 第69-71页 |
| 2 实验材料与方法 | 第71-76页 |
| 2.1 实验材料 | 第71-72页 |
| 2.1.1 实验动物 | 第71页 |
| 2.1.2 细胞系 | 第71页 |
| 2.1.3 质粒和细菌 | 第71页 |
| 2.1.4 抗体 | 第71页 |
| 2.1.5 实验耗材与设备 | 第71页 |
| 2.1.6 实验试剂 | 第71-72页 |
| 2.1.7 相关试剂配置 | 第72页 |
| 2.2 重组病毒的构建和鉴定实验方法 | 第72页 |
| 2.2.1 融合基因的构建 | 第72页 |
| 2.3 融合蛋白的表达与鉴定 | 第72页 |
| 2.4 血清特异性抗体及抗体亚型的滴度检测 | 第72页 |
| 2.5 AD小鼠行为学检测实验方法 | 第72-74页 |
| 2.5.1 水迷宫检测 | 第72-73页 |
| 2.5.2 旷场实验 | 第73页 |
| 2.5.3 Y-迷宫实验 | 第73-74页 |
| 2.6 小鼠脑中Aβ含量的检测 | 第74页 |
| 2.7 小鼠大脑老年斑块的形态学检测 | 第74-75页 |
| 2.8 小鼠脑中细胞因子浓度的检测 | 第75-76页 |
| 3 实验结果与分析 | 第76-97页 |
| 3.1 构建CTB-(Aβ42)_2融合基因 | 第76页 |
| 3.2 构建包含CTB-(Aβ42)_2融合基因的Bacmid载体 | 第76-79页 |
| 3.2.1 pFastBacl载体构建与鉴定 | 第76-77页 |
| 3.2.2 重组Bacmid质粒的构建与鉴定 | 第77页 |
| 3.2.3 重组杆状病毒的获得及鉴定 | 第77-79页 |
| 3.2.4 BmNPV-CTB-(Aβ42)_2病毒滴度检测 | 第79页 |
| 3.3 重组融合蛋白的表达及鉴定 | 第79-82页 |
| 3.3.1 重组融合蛋白在家蚕细胞和蚕蛹高效表达 | 第79-80页 |
| 3.3.2 Western Blot分析融合蛋白表达 | 第80-81页 |
| 3.3.3 GM1结合ELISA检测蛋白活性 | 第81-82页 |
| 3.4 AD小鼠血清抗体滴度检测 | 第82-83页 |
| 3.5 AD小鼠行为学检测 | 第83-90页 |
| 3.5.1 Morris水迷宫实验 | 第83-87页 |
| 3.5.2 旷场实验 | 第87-88页 |
| 3.5.3 Y-迷宫实验 | 第88-90页 |
| 3.6 口服CTB-(Aβ42)_2减少小鼠血清和脑组织Aβ水平检测 | 第90-91页 |
| 3.7 口服CTB-(Aβ42)_2减少AD小鼠大脑皮层和海马区老年斑面积 | 第91-92页 |
| 3.8 小鼠脑组织细胞因子检测 | 第92-93页 |
| 3.9 口服CTB-(Aβ42)_2改善AD小鼠PI3K/AKT信号通路 | 第93-94页 |
| 3.10 口服CTB-(Aβ42)_2降低小鼠Tau蛋白磷酸化水平 | 第94-97页 |
| 4 讨论 | 第97-99页 |
| 结论与展望 | 第99-100页 |
| 参考文献 | 第100-112页 |
| 作者简历 | 第112页 |
