| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-9页 |
| 目录 | 第9-13页 |
| 第1章 引言 | 第13-22页 |
| ·背景 | 第13-14页 |
| ·研究进展 | 第14-19页 |
| ·定向进化概述 | 第14-15页 |
| ·定向进化策略 | 第15-19页 |
| ·易错PCR | 第15-17页 |
| ·DNA改组 | 第17页 |
| ·突变体筛选策略 | 第17-19页 |
| ·定向进化的应用 | 第19页 |
| ·研究目的和意义 | 第19-20页 |
| ·研究思路 | 第20-21页 |
| ·技术路线 | 第21-22页 |
| 第2章 利用易错PCR技术构建突变体文库 | 第22-42页 |
| ·材料 | 第22-24页 |
| ·实验菌株及质粒 | 第22页 |
| ·培养基 | 第22-23页 |
| ·试剂 | 第23-24页 |
| ·核酸电泳试剂 | 第23页 |
| ·其他试剂 | 第23页 |
| ·实验用酶类、核酸标准及试剂盒 | 第23-24页 |
| ·主要仪器设备 | 第24页 |
| ·实验方法 | 第24-32页 |
| ·菌种活化与培养 | 第24页 |
| ·质粒提取 | 第24-25页 |
| ·引物设计 | 第25-26页 |
| ·易错PCR | 第26-27页 |
| ·重组质粒pET-28a(+)-MECH的构建 | 第27-29页 |
| ·表达载体pET-28a(+)与PCR产物的双酶切 | 第27-29页 |
| ·载体pET-28a(+)与目的基因MECH的连接 | 第29页 |
| ·重组质粒转化宿主菌 | 第29-30页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第29-30页 |
| ·转化 | 第30页 |
| ·转化子的鉴定 | 第30-32页 |
| ·转化子的鉴定 | 第30-31页 |
| ·标准PCR鉴定 | 第30-31页 |
| ·双酶切鉴定 | 第31页 |
| ·转化子的保存 | 第31-32页 |
| ·结果与讨论 | 第32-40页 |
| ·质粒提取 | 第32-33页 |
| ·易错PCR | 第33-35页 |
| ·表达载体pET-28a(+)与ep-PCR产物的双酶切 | 第35页 |
| ·重组质粒的构建流程 | 第35-37页 |
| ·重组质粒转化宿主菌 | 第37页 |
| ·转化子的鉴定 | 第37-40页 |
| ·标准PCR鉴定 | 第38-39页 |
| ·双酶切鉴定 | 第39-40页 |
| ·转化子的保存 | 第40页 |
| ·本章小结 | 第40-42页 |
| 第3章 突变文库的高通量筛选 | 第42-52页 |
| ·材料 | 第42-43页 |
| ·试剂 | 第42页 |
| ·主要仪器设备 | 第42-43页 |
| ·耗材、标准品 | 第43页 |
| ·细胞培养板的处理方法 | 第43页 |
| ·实验方法 | 第43-45页 |
| ·活化 | 第43页 |
| ·菌株培养与诱导 | 第43页 |
| ·筛选方法 | 第43-44页 |
| ·PNP标准曲线的建立 | 第44页 |
| ·生长曲线的测定 | 第44页 |
| ·优化菌株的序列测定 | 第44-45页 |
| ·结果与讨论 | 第45-51页 |
| ·活化 | 第45页 |
| ·PNP浓度标准曲线 | 第45页 |
| ·重组菌生长曲线测定 | 第45-46页 |
| ·高通量菌株筛选 | 第46-48页 |
| ·优化菌株的序列分析 | 第48-51页 |
| ·本章小结 | 第51-52页 |
| 第4章 发酵培养基的成分优化 | 第52-62页 |
| ·材料 | 第52-53页 |
| ·实验菌株 | 第52页 |
| ·培养基 | 第52页 |
| ·试剂 | 第52-53页 |
| ·主要仪器设备 | 第53页 |
| ·实验方法 | 第53-54页 |
| ·部分因子实验设计(Fractional Factorial Design,FFD) | 第53页 |
| ·Box-Behnken实验设计(Box-Behnken Design,BBD) | 第53页 |
| ·测定方法 | 第53-54页 |
| ·粗酶液的制备 | 第53-54页 |
| ·酶活的测定 | 第54页 |
| ·蛋白质的定量 | 第54页 |
| ·结果与讨论 | 第54-61页 |
| ·蛋白标准曲线的制作 | 第54-55页 |
| ·部分因子实验设计 | 第55-57页 |
| ·Box-Behnken实验设计 | 第57-61页 |
| ·本章小结 | 第61-62页 |
| 第5章 几丁质酶的分离纯化 | 第62-72页 |
| ·材料 | 第62-64页 |
| ·菌株 | 第62页 |
| ·培养基 | 第62页 |
| ·试剂 | 第62-64页 |
| ·柱层析缓冲液 | 第62页 |
| ·蛋白质电泳试剂 | 第62-64页 |
| ·主要仪器设备 | 第64页 |
| ·其他 | 第64页 |
| ·实验方法 | 第64-68页 |
| ·粗酶液的制备 | 第64-65页 |
| ·盐析 | 第65页 |
| ·盐析曲线的制作 | 第65页 |
| ·盐析 | 第65页 |
| ·DEAE阴离子交换层析 | 第65-66页 |
| ·填料处理与再生 | 第65页 |
| ·装柱 | 第65-66页 |
| ·层析 | 第66页 |
| ·凝胶过滤层析 | 第66-67页 |
| ·凝胶的溶胀 | 第66-67页 |
| ·装柱 | 第67页 |
| ·层析 | 第67页 |
| ·纯化效率 | 第67-68页 |
| ·结果与讨论 | 第68-71页 |
| ·盐析 | 第68页 |
| ·DEAE离子交换层析 | 第68-69页 |
| ·凝胶过滤纯化 | 第69-70页 |
| ·纯化效率 | 第70-71页 |
| ·本章小结 | 第71-72页 |
| 第6章 几丁质酶的性质研究 | 第72-78页 |
| ·材料 | 第72页 |
| ·实验菌株 | 第72页 |
| ·实验方法 | 第72-73页 |
| ·分子量测定 | 第72页 |
| ·动力学常数K_m值的测定 | 第72页 |
| ·温度对突变酶和原始酶活性的影响及其热稳定性研究 | 第72-73页 |
| ·pH对突变酶和原始酶活性的影响及其酸碱稳定性研究 | 第73页 |
| ·金属离子种类与强度对几丁质酶活性的影响 | 第73页 |
| ·结果与讨论 | 第73-77页 |
| ·分子量测定 | 第73-74页 |
| ·动力学常数K_m值的测定 | 第74页 |
| ·温度对突变酶和原始酶活性的影响及其热稳定性研究 | 第74-75页 |
| ·pH对突变酶和原始酶活性的影响及其酸碱稳定性研究 | 第75-76页 |
| ·金属离子种类与强度对几丁质酶活性的影响 | 第76-77页 |
| ·本章小结 | 第77-78页 |
| 第7章 结论 | 第78-81页 |
| ·结论 | 第78-79页 |
| ·创新点 | 第79页 |
| ·进一步研究的内容和建议 | 第79页 |
| ·研究展望 | 第79-81页 |
| 参考文献 | 第81-88页 |
| 致谢 | 第88-89页 |
