| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 第一章 绪论 | 第10-20页 |
| 1.1 CRISPR/Cas系统 | 第10-14页 |
| 1.1.1 CRISPR/Cas系统的研究历史 | 第10页 |
| 1.1.2 CRISPR/Cas系统的作用机制 | 第10-13页 |
| 1.1.3 CRISPR/Cas的应用 | 第13-14页 |
| 1.1.4 CRISPR/Cas技术的展望 | 第14页 |
| 1.2 猪圆环病毒 | 第14-17页 |
| 1.2.1 猪圆环病毒的发现与分类 | 第14-15页 |
| 1.2.2 猪圆环病毒的基因组 | 第15-16页 |
| 1.2.3 猪圆环病毒的疫苗研究情况 | 第16-17页 |
| 1.3 Rosa26基因 | 第17-18页 |
| 1.3.1 Rosa26基因的发现 | 第17-18页 |
| 1.3.2 在Rosa26位点进行定点基因敲入的优势 | 第18页 |
| 1.4 本研究的目的及意义 | 第18-20页 |
| 第二章 CRISPR/Cas9载体及打靶(供体)载体的构建 | 第20-46页 |
| 2.1 实验材料 | 第20-21页 |
| 2.1.1 质粒 | 第20页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第20-21页 |
| 2.1.3 主要仪器设备 | 第21页 |
| 2.2 实验方法 | 第21-38页 |
| 2.2.1 实验设计方案 | 第21-22页 |
| 2.2.2 载体信息 | 第22-23页 |
| 2.2.3 CRISPR/Cas9的构建 | 第23-24页 |
| 2.2.4 CRISPR/Cas-g1和CRISPR/Cas-g2工作效率的鉴定 | 第24-26页 |
| 2.2.5 实验所用引物序列 | 第26-28页 |
| 2.2.6 基于mpEGFP-C3克隆载体的PCV2功能蛋白基因表达盒构建 | 第28-33页 |
| 2.2.7 基于mpNTKV-Loxp载体的包含Rosa26位点左右同源臂载体的构建 | 第33-35页 |
| 2.2.8 基因打靶(供体)载体(Donor载体)的构建 | 第35-38页 |
| 2.3 实验结果 | 第38-43页 |
| 2.3.1 CRISPR/Cas9的构建 | 第38-39页 |
| 2.3.2 Cas9-pRosa26-g1和Cas9-pRosa26-g2的切割效率验证 | 第39-40页 |
| 2.3.3 重组质粒酶切验证及测序 | 第40-41页 |
| 2.3.4 PCR鉴定左右同源臂载体 | 第41-42页 |
| 2.3.5 最终重组Donor载体的单酶切鉴定 | 第42-43页 |
| 2.4 讨论 | 第43-46页 |
| 第三章 Rosa26位点定点敲入细胞系的筛选 | 第46-57页 |
| 3.1 实验材料 | 第46-47页 |
| 3.1.1 细胞及质粒 | 第46页 |
| 3.1.2 主要试剂及仪器设备 | 第46-47页 |
| 3.2 实验方法 | 第47-52页 |
| 3.2.1 实验设计方案 | 第47页 |
| 3.2.2 PK15细胞的复苏、传代及冻存 | 第47-48页 |
| 3.2.3 鉴定PK15细胞是否存在PCV的污染 | 第48-49页 |
| 3.2.4 根据设计的Donor载体筛选最佳的通用检测引物 | 第49-50页 |
| 3.2.5 利用G418筛选定点整合至猪基因组Rosa26位点的细胞系 | 第50-52页 |
| 3.3 实验结果 | 第52-56页 |
| 3.3.1 PK15细胞PCR鉴定结果 | 第52-53页 |
| 3.3.2 选择转染的最佳比例和G418的筛选的最佳浓度 | 第53-54页 |
| 3.3.3 单克隆细胞的筛选 | 第54页 |
| 3.3.4 单克隆阳性细胞的鉴定 | 第54-56页 |
| 3.4 讨论 | 第56-57页 |
| 第四章 结论与展望 | 第57-58页 |
| 4.1 结论 | 第57页 |
| 4.2 展望 | 第57-58页 |
| 参考文献 | 第58-64页 |
| 致谢 | 第64-65页 |
| 作者简历 | 第65页 |
