| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 英文缩略符号表 | 第9-14页 |
| 1 绪论 | 第14-25页 |
| 1.1 穿心莲 | 第14-15页 |
| 1.2 萜类化合物 | 第15-18页 |
| 1.2.1 萜类化合物的概念 | 第15页 |
| 1.2.2 萜类化合物的生物合成途径 | 第15-17页 |
| 1.2.3 萜类化合物的生物活性 | 第17-18页 |
| 1.3 二萜天然产物 | 第18页 |
| 1.4 萜烯合酶 | 第18-20页 |
| 1.5 穿心莲内酯的生物合成途径 | 第20-22页 |
| 1.6 微生物代谢工程 | 第22-23页 |
| 1.7 病毒诱导基因沉默 | 第23-25页 |
| 1.7.1 病毒诱导基因沉默的原理 | 第23页 |
| 1.7.2 病毒载体 | 第23-24页 |
| 1.7.3 PDS作为VIGS的报告基因 | 第24-25页 |
| 2 材料及方法 | 第25-40页 |
| 2.1 试验材料 | 第25页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第25页 |
| 2.1.2 载体及菌株 | 第25页 |
| 2.2 仪器与试剂 | 第25-26页 |
| 2.2.1 仪器及酶试剂 | 第25页 |
| 2.2.2 主要试剂溶液的配制 | 第25-26页 |
| 2.3 试验设计 | 第26-28页 |
| 2.4 基因的克隆与检测 | 第28-34页 |
| 2.4.1 ApCPS基因的克隆 | 第28-31页 |
| 2.4.1.1 穿心莲中总RNA的提取 | 第28页 |
| 2.4.1.2 RNA的纯度、浓度的检测 | 第28页 |
| 2.4.1.3 反转录合成cDNA | 第28-29页 |
| 2.4.1.4 PCR扩增体系 | 第29页 |
| 2.4.1.5 目的片段的回收和pGM-T载体的连接 | 第29-30页 |
| 2.4.1.6 连接产物的转化 | 第30页 |
| 2.4.1.7 阳性克隆的筛选和重组质粒的鉴定 | 第30-31页 |
| 2.4.2 ApPDS基因同源克隆及RACE技术 | 第31-32页 |
| 2.4.3 RT-PCR检测基因的表达 | 第32-33页 |
| 2.4.3.1 ApCPS基因的组织特异性表达 | 第32页 |
| 2.4.3.2 ApPDS基因的组织特异性表达 | 第32页 |
| 2.4.3.3 RT-PCR检测VIGS后基因的表达 | 第32-33页 |
| 2.4.4 qRT-PCR检测基因的表达 | 第33-34页 |
| 2.4.4.1 qRT-PCR检测ApCPS响应MeJA的诱导表达 | 第33页 |
| 2.4.4.2 qRT-PCR检测VIGS后基因的表达 | 第33-34页 |
| 2.5 含量测定 | 第34-35页 |
| 2.5.1 TLC检测不同组织中穿心莲内酯类的含量 | 第34页 |
| 2.5.2 HPLC检测穿心莲体内的穿心莲内酯类含量 | 第34-35页 |
| 2.6 大肠杆菌代谢工程 | 第35-38页 |
| 2.6.1 蛋白表达载体的构建 | 第35-36页 |
| 2.6.2 ApCPS蛋白的定点突变 | 第36页 |
| 2.6.3 表达产物的萃取与检测 | 第36-38页 |
| 2.6.3.1 产物的表达与萃取 | 第36-37页 |
| 2.6.3.2 GC-MS检测条件 | 第37-38页 |
| 2.7 病毒诱导基因沉默体系的建立 | 第38-39页 |
| 2.7.1 病毒诱导基因沉默载体的构建 | 第38页 |
| 2.7.2 农杆菌的浸染 | 第38-39页 |
| 2.8 生物信息学分析及数据的处理 | 第39-40页 |
| 3 结果与分析 | 第40-55页 |
| 3.1 APCPS体外功能的鉴定 | 第40-46页 |
| 3.1.1 ApCPS的基因克隆和表达分析 | 第40-43页 |
| 3.1.2 穿心莲内酯类化合物在不同组织中的含量测定 | 第43页 |
| 3.1.3 大肠杆菌代谢工程鉴定ApCPS的体外功能 | 第43-46页 |
| 3.1.3.1 重组表达和产物的鉴定 | 第43页 |
| 3.1.3.2 CPP产物立体结构的鉴定 | 第43-45页 |
| 3.1.3.3 保守结构域的确认 | 第45-46页 |
| 3.2 穿心莲体内VIGS的建立 | 第46-51页 |
| 3.2.1 ApPDS的基因克隆及表达分析 | 第46-50页 |
| 3.2.1.1 ApPDS核心片段的克隆 | 第46-47页 |
| 3.2.1.2 ApPDS 3'端和5'端的克隆 | 第47页 |
| 3.2.1.3 ApPDS全长cDNA的拼接及其编码区的克隆 | 第47-48页 |
| 3.2.1.4 ApPDS的生物信息学分析 | 第48-49页 |
| 3.2.1.5 ApPDS的组织特异性表达分析 | 第49-50页 |
| 3.2.2 ApPDS体内功能的鉴定 | 第50-51页 |
| 3.2.2.1 沉默ApPDS后植物表型的变化 | 第50-51页 |
| 3.2.2.2 qRT-PCR检测ApPDS基因的表达 | 第51页 |
| 3.3 APCPS在穿心莲体内的功能鉴定 | 第51-55页 |
| 3.3.1 RT-PCR和qRT-PCR检测ApCPS的沉默效果 | 第52页 |
| 3.3.2 HPLC法检测ApCPS沉默后穿心莲内酯的含量 | 第52-53页 |
| 3.3.3 ApCPS沉默后穿心莲内酯生物合成上游基因的表达检测 | 第53-55页 |
| 4 讨论与结论 | 第55-60页 |
| 4.1 讨论 | 第55-57页 |
| 4.2 结论 | 第57-58页 |
| 4.3 展望 | 第58-60页 |
| 参考文献 | 第60-72页 |
| 致谢 | 第72-73页 |
| 附录 | 第73-75页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 | 第75页 |
