| 中国农业科学院博士学位论文评阅人、答辩委员会签名表 | 第1-5页 |
| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6-15页 |
| 英文缩略表 | 第15-16页 |
| 第一章 引言 | 第16-34页 |
| ·牛病毒性腹泻病与牛病毒性腹泻病毒 | 第16-17页 |
| ·牛病毒性腹泻病 | 第16页 |
| ·牛病毒性腹泻病毒 | 第16-17页 |
| ·牛病毒性腹泻病毒侵染细胞 | 第17-18页 |
| ·BVDV 的粘附和侵入 | 第17页 |
| ·BVDV 的翻译和复制 | 第17-18页 |
| ·病毒蛋白和宿主蛋白相互作用的研究进展 | 第18-21页 |
| ·结构蛋白的研究现状 | 第19-20页 |
| ·非结构蛋白的研究现状 | 第20-21页 |
| ·BVDV 感染的免疫应答反应 | 第21-25页 |
| ·先天性免疫应答 | 第21页 |
| ·体液免疫应答 | 第21-23页 |
| ·细胞免疫应答 | 第23页 |
| ·免疫抑制 | 第23-25页 |
| ·BVDV 流行状况及诊断 | 第25-29页 |
| ·国内流行情况 | 第25-26页 |
| ·国外流行情况 | 第26-27页 |
| ·BVDV 的诊断 | 第27-29页 |
| ·病毒感染与细胞自噬 | 第29-33页 |
| ·自噬抵抗病毒感染 | 第31-32页 |
| ·自噬促进病毒感染 | 第32-33页 |
| ·本研究的目的和意义 | 第33-34页 |
| 第二章 西北地区牛病毒性腹泻病毒的分子流行病学调查 | 第34-46页 |
| 摘要 | 第34页 |
| ·材料 | 第34-35页 |
| ·病料 | 第34-35页 |
| ·细胞株和菌种 | 第35页 |
| ·相关试剂和耗材 | 第35页 |
| ·溶液及培养基 | 第35页 |
| ·方法 | 第35-37页 |
| ·病毒 RNA 的提取和 cDNA 的合成 | 第35-36页 |
| ·引物的设计和 RT-PCR 扩增 | 第36页 |
| ·系统进化分析 | 第36-37页 |
| ·BVDV 抗原检测 | 第37页 |
| ·病料的处理及病毒的分离 | 第37页 |
| ·病毒的电镜观察 | 第37页 |
| ·直接免疫荧光检测 | 第37页 |
| ·结果 | 第37-44页 |
| ·宁夏奶牛血样中 BVDV 检测 | 第37-38页 |
| ·宁夏奶牛血样 5′UTR 序列分析 | 第38-39页 |
| ·宁夏奶牛 BVDV 的分离及鉴定 | 第39-40页 |
| ·青海牦牛血清中 BVDV 的检测 | 第40-41页 |
| ·青海牦牛血清中 5′UTR 和 Npro序列分析 | 第41-44页 |
| ·讨论 | 第44-46页 |
| 第三章 BVDV Core 和 Npro蛋白的原核表达及多抗的制备 | 第46-58页 |
| 摘要 | 第46页 |
| ·材料 | 第46-48页 |
| ·实验动物 | 第46页 |
| ·仪器设备 | 第46-47页 |
| ·毒株、表达载体及菌种 | 第47页 |
| ·实验试剂和酶 | 第47页 |
| ·培养基及溶液 | 第47-48页 |
| ·方法 | 第48-52页 |
| ·病毒 RNA 的提取和 cDNA 的合成 | 第48页 |
| ·Core 和 Npro蛋白基因引物设计 | 第48页 |
| ·Core 和 Npro蛋白基因的 PCR 扩增 | 第48页 |
| ·Core 和 Npro蛋白基因分别与 pET-30a 连接 | 第48-50页 |
| ·pET-30a-Core/Npro重组质粒的诱导表达 | 第50页 |
| ·Core 和 Npro重组蛋白的可溶性分析 | 第50页 |
| ·Core 和 Npro重组蛋白的纯化 | 第50-51页 |
| ·蛋白质的 Western-blot 检测 | 第51页 |
| ·Core 和 Npro重组蛋白的浓度测定 | 第51页 |
| ·多克隆抗体的制备和检测 | 第51页 |
| ·间接免疫荧光检测 | 第51-52页 |
| ·结果 | 第52-56页 |
| ·Core 和 Npro蛋白基因的 PCR 扩增和质粒鉴定 | 第52-53页 |
| ·Core 和 Npro重组蛋白的表达 | 第53-54页 |
| ·Core 和 Npro重组蛋白的纯化和抗原性鉴定 | 第54-55页 |
| ·多克隆抗体的检测 | 第55-56页 |
| ·讨论 | 第56-58页 |
| 第四章 细胞自噬在 BVDV 感染复制中的作用 | 第58-71页 |
| 摘要 | 第58页 |
| ·材料 | 第58-59页 |
| ·毒株和细胞株 | 第58-59页 |
| ·质粒和相关抗体 | 第59页 |
| ·相关试剂 | 第59页 |
| ·仪器设备 | 第59页 |
| ·相关溶液 | 第59页 |
| ·方法 | 第59-62页 |
| ·Western-blot 检测 LC3 脂酰化及 Npro蛋白的表达 | 第59-60页 |
| ·Wortmannin 处理对 LC3 脂酰化及 Npro蛋白表达的影响 | 第60页 |
| ·检测 GFP-LC3 在细胞中的聚集 | 第60-61页 |
| ·透射电镜观察自噬体的形成 | 第61页 |
| ·Western-blot 检测 p62 的降解 | 第61-62页 |
| ·Beclin-1 的干扰对 LC3 脂酰化及病毒复制的影响 | 第62页 |
| ·结果 | 第62-69页 |
| ·Western-blot 检测 LC3 脂酰化及 Npro蛋白的表达 | 第62-63页 |
| ·Wortmannin 处理对 LC3 脂酰化及 Npro蛋白表达的影响 | 第63-64页 |
| ·pEGFP-N1/LC3 转染 MDBK 检测自噬体的形成 | 第64-65页 |
| ·透射电镜观察自噬体 | 第65-66页 |
| ·Western-blot 检测 p62 的降解 | 第66-67页 |
| ·Beclin-1 的干扰对 LC3 脂酰化及病毒复制的影响 | 第67-69页 |
| ·讨论 | 第69-71页 |
| 第五章 酵母双杂交系统筛选与 Core 相互作用的宿主蛋白 | 第71-93页 |
| 摘要 | 第71-72页 |
| ·材料 | 第72-73页 |
| ·仪器设备 | 第72页 |
| ·毒株、表达载体、菌株、抗体及文库 | 第72页 |
| ·实验试剂及试剂盒 | 第72页 |
| ·培养基及溶液 | 第72-73页 |
| ·方法 | 第73-79页 |
| ·cDNA 文库的构建 | 第73-74页 |
| ·Core 蛋白基因的引物设计 | 第74页 |
| ·Core 蛋白基因的 PCR 扩增 | 第74页 |
| ·诱饵质粒 pGBKT7-Core 的构建 | 第74页 |
| ·酵母双杂交试验 | 第74-76页 |
| ·回交验证 | 第76-77页 |
| ·免疫共沉淀 | 第77-78页 |
| ·激光共聚焦 | 第78-79页 |
| ·Core 和 PIAS4 相互作用对病毒复制的影响 | 第79页 |
| ·结果 | 第79-91页 |
| ·牛外周血单个核细胞总 RNA 的提取 | 第79-80页 |
| ·牛外周血单个核细胞 cDNA 文库的鉴定 | 第80-81页 |
| ·诱饵质粒 pGBKT7-Core 的构建 | 第81页 |
| ·诱饵质粒自激活性和毒性的检测 | 第81页 |
| ·酵母双杂对照试验的建立 | 第81-83页 |
| ·酵母双杂交筛选 PBMC cDNA 文库 | 第83页 |
| ·阳性克隆的鉴定及测序结果 | 第83-84页 |
| ·回交验证 | 第84-86页 |
| ·免疫共沉淀验证 Core 与 PIAS4 的相互作用 | 第86-88页 |
| ·激光共聚焦检测 Core 与 PIAS4 的共定位 | 第88-89页 |
| ·沉默 PIAS4 抑制 Core 蛋白的表达和 BVDV 的增殖 | 第89-90页 |
| ·过表达 PIAS4 增加 Core 蛋白的表达和 BVDV 的增殖 | 第90-91页 |
| ·讨论 | 第91-93页 |
| 第六章 全文结论 | 第93-94页 |
| 参考文献 | 第94-108页 |
| 致谢 | 第108-109页 |
| 作者简历 | 第109页 |
