| 人SIRT1H363Y心脏特异转基因小鼠的建立及其导致扩张型心肌病和心力衰竭的机制研究 | 第1-93页 |
| 目录 | 第3-7页 |
| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-12页 |
| 前言 | 第12-24页 |
| 1.以心力衰竭为基础的心脏疾病对人类健康危害严重 | 第12页 |
| 2.心力衰竭是一个多因素多环节的漫长过程 | 第12-14页 |
| ·心力衰竭具有复杂病理生理过程 | 第12-13页 |
| ·心力衰竭可通过多种机制发生,有多种因素相互交错 | 第13-14页 |
| 3 扩张型心肌病的主要症状是心力衰竭 | 第14-15页 |
| 4.心肌细胞凋亡(apoptosis)是扩张型心肌病和心力衰竭发生的重要环节 | 第15-18页 |
| ·心肌细胞凋亡途径包括外源性和内源性凋亡通路 | 第15-17页 |
| ·Bcl-2家族蛋白是线粒体途径的心肌细胞凋亡中主要介导分子 | 第17-18页 |
| ·细胞凋亡途径作为治疗的潜在靶点 | 第18页 |
| 5.人SIRT1的功能提示它可能具有抗心肌细胞凋亡的作用 | 第18-21页 |
| 6.降低SIRT1的去乙酰化酶活性是否对心脏的功能有影响以及可能的分子机制是本研究的要点 | 第21-24页 |
| 实验材料 | 第24-27页 |
| 1.质粒 | 第24页 |
| 2.菌株 | 第24页 |
| 3.实验用大、小鼠及饲料 | 第24页 |
| 4.限制性内切酶和其他修饰酶 | 第24-25页 |
| 5.其他主要试剂 | 第25页 |
| 6.放射性核素 | 第25页 |
| 7.主要仪器设备 | 第25-27页 |
| 实验方法 | 第27-52页 |
| 1.克隆构建 | 第27-29页 |
| ·用于制备转基因的α-MHC-SIRT1H363Y的克隆构建 | 第27-29页 |
| 2.质粒DNA和重组腺病毒的制备与纯化 | 第29-33页 |
| ·质粒DNA的大量制备 | 第29页 |
| ·质粒DNA的酶切与纯化 | 第29-30页 |
| ·显微注射用质粒DNA的酶切与纯化 | 第29-30页 |
| ·质粒DNA的鉴定 | 第30页 |
| ·重组腺病毒的制备和检测 | 第30-33页 |
| ·重组腺病毒毒株 | 第30-31页 |
| ·重组腺病毒的制备 | 第31-33页 |
| ·备用细胞的储备 | 第31页 |
| ·建立备用病毒 | 第31-32页 |
| ·重组腺病毒Ad-GFP、Ad-SIRT1和Ad-SIRT1H363Y的生产 | 第32页 |
| ·病毒纯化 | 第32-33页 |
| ·重组腺病毒质量检测 | 第33页 |
| 3.受精卵培养基的配制与保存 | 第33-35页 |
| ·M2和M16储存液的成分及配制 | 第33-34页 |
| ·M2和M16工作液的配制 | 第34-35页 |
| 4.小鼠的选择与处理 | 第35-36页 |
| 5.超排卵和取卵 | 第36页 |
| 6.显微注射 | 第36-39页 |
| ·持卵针的制备 | 第36页 |
| ·显微注射针的拉制 | 第36-37页 |
| ·显微注射槽的制备 | 第37页 |
| ·显微注射 | 第37-39页 |
| 7.输卵管移卵 | 第39-41页 |
| ·移卵针的制备 | 第39页 |
| ·受精卵在移卵针中的排列 | 第39页 |
| ·输卵管移卵 | 第39-41页 |
| 8.转基因小鼠的检测 | 第41-42页 |
| ·利用PCR鉴定转基因小鼠 | 第41页 |
| ·利用Southern杂交鉴定转基因小鼠 | 第41-42页 |
| ·鼠尾基因组DNA的提取 | 第41-42页 |
| ·Southern杂交鉴定转基因小鼠 | 第42页 |
| 9.心肌肥厚动物模型建立 | 第42-43页 |
| 10.新生大鼠心肌细胞分离和培养 | 第43-44页 |
| ·心肌细胞的分离 | 第43页 |
| ·心肌细胞的纯化 | 第43页 |
| ·心肌细胞生长和活力观察 | 第43-44页 |
| ·心肌细胞的处理 | 第44页 |
| 11.心重和体重的测定 | 第44页 |
| 12.超声心动图分析 | 第44-45页 |
| 13.电子显微镜分析 | 第45页 |
| 14.组织RNA提取 | 第45-47页 |
| 15.组织蛋白提取部分 | 第47-48页 |
| ·蛋白提取缓冲液RIPA的成分 | 第47-48页 |
| ·用RIPA缓冲液提取组织蛋白 | 第48页 |
| 16.Western blot | 第48-49页 |
| ·变性PAGE胶电泳 | 第48页 |
| ·转膜 | 第48-49页 |
| ·免疫反应 | 第49页 |
| ·ECL反应 | 第49页 |
| 17.HE染色和Masson染色 | 第49-50页 |
| ·石蜡制片流程: | 第49-50页 |
| ·HE染色流程(Harris苏木素一伊红染色法) | 第50页 |
| ·Masson染色 | 第50页 |
| 18.免疫组化 | 第50-51页 |
| 19.统计学方法 | 第51-52页 |
| 实验结果 | 第52-75页 |
| 1.压力超负荷诱导的大鼠心肌肥厚模型中SIRT1表达增加 | 第52-53页 |
| 2.α-MHC-SIRT1H363Y质粒克隆的构建 | 第53页 |
| 3.显微注射用DNA的制备 | 第53-54页 |
| 4.转基因鼠系的建立 | 第54-57页 |
| ·转基因鼠系的建立 | 第54-55页 |
| ·转基因鼠系的表达鉴定 | 第55-56页 |
| ·转基因小鼠中内源性的Sir2α表达 | 第56-57页 |
| 5.转基因在动物体内正确的组织特异性表达 | 第57-58页 |
| 6.转基因小鼠心脏扩张和早期致死 | 第58-59页 |
| 7.转基因小鼠发生扩张型心肌病 | 第59-65页 |
| ·心脏/体重的检测 | 第59-60页 |
| ·转基因小鼠的超声检查 | 第60-62页 |
| ·α-MHC-SIRT1H363Y转基因小鼠的病理检查 | 第62-64页 |
| ·转基因小鼠的电镜检查 | 第64-65页 |
| 8.转基因小鼠心脏出现心力衰竭 | 第65-66页 |
| 9.转基因小鼠的心肌细胞凋亡增加 | 第66-67页 |
| 10.转基因小鼠的心肌细胞中caspase-3的活性增加 | 第67-68页 |
| 11.SIRT1H363Y上调心肌组织p53乙酰化水平和Bax基因表达的升高 | 第68-73页 |
| ·转基因小鼠心脏中Bax和TNF-α的表达增加 | 第68-69页 |
| ·转基因小鼠心脏中线粒体相关的分子发生明显的改变 | 第69-70页 |
| ·转基因小鼠心脏中Bax的mRNA表达显著增加 | 第70-71页 |
| ·转基因小鼠心脏中p53的乙酰化水平显著增加 | 第71-72页 |
| ·转基因小鼠心脏中p53的其他下游的改变 | 第72-73页 |
| 12.SIRT1H363Y导致原代培养的新生大鼠心肌细胞中p53乙酰化水平和Bax的基因表达的升高 | 第73-75页 |
| 讨论 | 第75-87页 |
| 1.转基因小鼠发生了扩张型心肌病和心力衰竭 | 第75-76页 |
| 2.转基因小鼠导致扩张型心肌病和心力衰竭的细胞机制 | 第76-80页 |
| ·转基因小鼠心肌细胞凋亡的增加 | 第77-78页 |
| ·转基因小鼠并没有发生明显的心肌肥厚和炎症 | 第78-79页 |
| ·单纯的心肌细胞凋亡导致扩张型心肌病和心力衰竭 | 第79-80页 |
| 3.转基因小鼠导致扩张型心肌病和心力衰竭的分子机制 | 第80-83页 |
| ·P53乙酰化水平的升高和Bax基因表达的增加参与了SIRT1H363Y导致的扩张型心肌病和心力衰竭 | 第80-81页 |
| ·Bax依赖的线粒体凋亡途径参与了SIRT1H363Y导致的扩张型心肌病和心力衰竭 | 第81-82页 |
| ·SIRT1H363Y导致扩张型心肌病和心力衰竭的机制总结 | 第82-83页 |
| 4.SIRT1既是早期发育重要因子,又是参与正常的心肌细胞增长和病理性肥厚的重要因子 | 第83-86页 |
| ·SIRT1参与心脏发育 | 第84页 |
| ·SIRT1参与细胞生存和生理性增殖 | 第84-85页 |
| ·SIRT1参与病理性心肌肥厚 | 第85-86页 |
| 5.本研究的不足与展望 | 第86-87页 |
| 参考文献 | 第87-92页 |
| 小结 | 第92-93页 |
| 文献综述 | 第93-105页 |
| 英文名词及缩写 | 第105-107页 |
| 致谢 | 第107-108页 |
| 个人简历 | 第108-110页 |
