牛病毒性腹泻病毒全基因克隆及核酸疫苗初步研究
| 摘要 | 第1-12页 |
| Abstract | 第12-14页 |
| 1 引言 | 第14-34页 |
| ·BVDV生物学特性 | 第14-15页 |
| ·BVDV形态和理化学特性 | 第14页 |
| ·BVDV分类位置 | 第14-15页 |
| ·BVDV的分型 | 第15页 |
| ·BVDV基因组及其编码蛋白 | 第15-20页 |
| ·BVDV基因组结构 | 第15-17页 |
| ·BVDV编码的蛋白及功能 | 第17-20页 |
| ·BVDV的临床症状 | 第20-21页 |
| ·繁殖障碍与持续感染 | 第20页 |
| ·黏膜病 | 第20页 |
| ·急性BVD | 第20-21页 |
| ·免疫抑制及呼吸道并发症 | 第21页 |
| ·血小板减少症 | 第21页 |
| ·BVDV引起黏膜病的分子机制 | 第21-23页 |
| ·病毒基因与宿主细胞基因的重组 | 第21-22页 |
| ·病毒基因的重复复制及重排 | 第22页 |
| ·病毒基因重复复制和插入序列同时存在 | 第22页 |
| ·病毒基因的缺失 | 第22-23页 |
| ·对BVDV控制的研究 | 第23-29页 |
| ·BVDV检测技术 | 第23-24页 |
| ·BVDV免疫的研究 | 第24-27页 |
| ·新型BVDV疫苗的研究 | 第27-29页 |
| ·BVDV全长cDNA感染性克隆研究进展 | 第29-32页 |
| ·BVDV病毒感染性克隆技术 | 第30页 |
| ·BVDV感染性克隆的研究 | 第30-32页 |
| ·本试验研究的目的和意义 | 第32-34页 |
| 2 材料与方法 | 第34-52页 |
| ·实验材料 | 第34-36页 |
| ·实验动物 | 第34页 |
| ·质粒与菌株 | 第34页 |
| ·病毒与细胞 | 第34-35页 |
| ·主要试剂 | 第35-36页 |
| ·主要仪器 | 第36页 |
| ·BVDV全基因的克隆 | 第36-40页 |
| ·引物设计 | 第36-37页 |
| ·BVDV基因组RNA的提取 | 第37页 |
| ·反转录合成cDNA | 第37-38页 |
| ·PCR反应扩增目的基因 | 第38页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第38-39页 |
| ·PCR产物的克隆与转化 | 第39页 |
| ·重组质粒阳性克隆的筛选与鉴定 | 第39页 |
| ·序列测定和比较 | 第39-40页 |
| ·全长cDNA的连接 | 第40-45页 |
| ·5′端引入T7启动子核心序列 | 第40页 |
| ·T7-5′片段反转录扩增 | 第40页 |
| ·T7-5′片段克隆、转化及鉴定 | 第40-41页 |
| ·全长cDNA克隆的构建 | 第41-42页 |
| ·融合PCR构建BVDV全长cDNA | 第42-45页 |
| ·P14、E2、NS3真核表达载体的构建 | 第45-49页 |
| ·PCR扩增引物设计 | 第45页 |
| ·P14、E2、NS3基因的扩增 | 第45-46页 |
| ·PCR产物的克隆与转化 | 第46页 |
| ·重组质粒阳性克隆的筛选与鉴定 | 第46-47页 |
| ·序列测定和比较 | 第47页 |
| ·真核表达载体的构建及体外表达 | 第47-49页 |
| ·DNA疫苗对小鼠免疫效果的研究 | 第49-52页 |
| ·DNA疫苗质粒的大量制备及其纯化 | 第49页 |
| ·小鼠的免疫接种实验 | 第49-50页 |
| ·抗体的检测 | 第50页 |
| ·小鼠淋巴细胞IFN-γ分泌水平检测 | 第50-51页 |
| ·外周血T淋巴细胞亚类动态变化的监测 | 第51-52页 |
| 3 结果 | 第52-66页 |
| ·BVDV病毒全基因克隆及序列分析 | 第52页 |
| ·重组质粒鉴定 | 第52-56页 |
| ·基因结构 | 第56页 |
| ·与参考毒株基因核苷酸序列比较和同源性分析 | 第56-57页 |
| ·参考毒株基因氨基酸序列比较和同源性分析 | 第57-58页 |
| ·BVDV全长cDNA的构建 | 第58-60页 |
| ·5′端和3′端半长的构建 | 第58-59页 |
| ·长片段融合PCR | 第59-60页 |
| ·重组真核表达载体的构建 | 第60-64页 |
| ·目的基因的扩增 | 第60页 |
| ·重组质粒鉴定 | 第60-61页 |
| ·重组真核表达载体的构建 | 第61-63页 |
| ·重组真核载体表达产物的荧光检测 | 第63-64页 |
| ·核酸疫苗对小鼠的免疫效果研究 | 第64-66页 |
| ·抗体检测 | 第64页 |
| ·小鼠淋巴细胞IFN-γ分泌水平检测 | 第64-65页 |
| ·T细胞亚类检测 | 第65-66页 |
| 4 讨论 | 第66-72页 |
| ·BVDV的全基因克隆 | 第66-67页 |
| ·病毒繁殖与基因扩增 | 第66页 |
| ·序列比较 | 第66-67页 |
| ·BVDV全长cDNA的构建 | 第67-68页 |
| ·获得真实的cDNA片段 | 第67页 |
| ·关于cDNA的稳定性 | 第67页 |
| ·长片段融合PCR在构建BVDV cDNA的应用 | 第67-68页 |
| ·启动子的选择 | 第68页 |
| ·瞬时表达载体及细胞的选择 | 第68-69页 |
| ·核酸疫苗对小鼠免疫功能的影响 | 第69-72页 |
| ·ELISA法对抗体的检测 | 第69页 |
| ·体液免疫 | 第69-70页 |
| ·重组真核表达载体对小鼠INF-γ的影响 | 第70页 |
| ·关于T细胞亚型分类 | 第70-72页 |
| 5 结论 | 第72-73页 |
| 致谢 | 第73-74页 |
| 参考文献 | 第74-90页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第90页 |
