| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 缩略词表 | 第7-11页 |
| 第一章 文献综述 | 第11-22页 |
| 1. 干扰素的概况 | 第11-14页 |
| ·干扰素的产生和分类 | 第11-12页 |
| ·干扰素的性质和生物学特性 | 第12-13页 |
| ·干扰素的基本特性 | 第12页 |
| ·干扰素的生物学特性 | 第12-13页 |
| ·水禽干扰素国内外研究进展 | 第13-14页 |
| ·兽用干扰素的临床应用 | 第14页 |
| 2 利用毕赤酵母表达外源蛋白的研究 | 第14-21页 |
| ·简介 | 第14-15页 |
| ·毕赤酵母表达系统的生物学特点 | 第14-15页 |
| ·甲醇酵母的代谢 | 第15页 |
| ·甲醇利用表型 | 第15页 |
| ·表达系统的启动子 | 第15-17页 |
| ·AOX1启动子和GAP启动子 | 第15-16页 |
| ·AOX2启动子 | 第16页 |
| ·FLD1启动子 | 第16页 |
| ·ICL1启动子 | 第16-17页 |
| ·控制蛋白质水解作用 | 第17-18页 |
| ·培养水平策略 | 第17-18页 |
| ·细胞水平策略 | 第18页 |
| ·蛋白质水平策略 | 第18页 |
| ·分泌蛋白的翻译后修饰 | 第18-19页 |
| ·分泌信号作用及二硫键的形成 | 第19页 |
| ·糖基化 | 第19页 |
| ·影响外源蛋白表达的因素 | 第19-20页 |
| ·外源基因的内在特性 | 第19-20页 |
| ·基因拷贝数 | 第20页 |
| ·宿主菌的甲醇利用表型 | 第20页 |
| ·培养条件 | 第20页 |
| ·展望 | 第20-21页 |
| 3. 研究的目的及意义 | 第21-22页 |
| 第二章 干扰素的克隆与真核表达载体的构建 | 第22-34页 |
| 1. 实验材料 | 第22-24页 |
| ·菌株/载体/质粒 | 第22页 |
| ·实验仪器及试剂 | 第22-23页 |
| ·主要的仪器设备 | 第22页 |
| ·主要试剂 | 第22-23页 |
| ·相关溶液的配制 | 第23-24页 |
| 2. 实验方法 | 第24-30页 |
| ·干扰素成熟蛋白基因的PCR扩增、克隆和鉴定 | 第24-28页 |
| ·引物的设计与合成 | 第24页 |
| ·鹅干扰素α基因的PCR扩增 | 第24-25页 |
| ·扩增产物的回收与纯化 | 第25页 |
| ·PCR纯化产物与克隆载体的连接 | 第25页 |
| ·大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 | 第25-26页 |
| ·转化感受态 | 第26页 |
| ·重组质粒的PCR和酶切鉴定 | 第26-28页 |
| ·重组真核表达质粒的构建 | 第28-30页 |
| ·pMDT-IFNα与表达载体pPICZαA的提取、酶切与回收 | 第28页 |
| ·pMDT-IFNα与表达载体pPICZαA的连接 | 第28-29页 |
| ·连接产物的转化 | 第29页 |
| ·转化菌落的PCR及酶切鉴定 | 第29-30页 |
| 3. 结果 | 第30-32页 |
| ·天府肉鹅干扰素基因的克隆与鉴定 | 第30-31页 |
| ·鹅IFN-α的PCR鉴定 | 第30页 |
| ·重组质粒pMDT-IFNα双酶切鉴定 | 第30-31页 |
| ·真核表达载体的构建及鉴定 | 第31-32页 |
| 4. 讨论 | 第32-34页 |
| ·引物的设计 | 第32-33页 |
| ·表达载体的选择 | 第33-34页 |
| 第三章 鹅干扰素在毕赤酵母中的表达及抗病毒活性 | 第34-56页 |
| 1. 实验材料 | 第34-38页 |
| ·菌株/质粒/病毒 | 第34页 |
| ·主要试剂 | 第34页 |
| ·相关溶液的配制 | 第34-38页 |
| 2. 实验方法 | 第38-46页 |
| ·携带目的基因的重组酵母的构建 | 第38-41页 |
| ·真核表达质粒pPICZαA-IFNα的线性化 | 第38-39页 |
| ·线性化质粒的纯化 | 第39页 |
| ·感受态X-33的制备 | 第39-40页 |
| ·毕赤酵母的电击转化 | 第40页 |
| ·重组酵母基因组PCR鉴定 | 第40-41页 |
| ·酵母转化子的诱导表达 | 第41-43页 |
| ·Mut型重组酵母的初步诱导表达 | 第41-42页 |
| ·斑点法筛选高表达菌株 | 第42页 |
| ·表达条件的优化 | 第42-43页 |
| ·双抗体夹心ELISA检测表达条件的优化 | 第43页 |
| ·酵母表达天府肉鹅干扰素蛋白的鉴定 | 第43-45页 |
| ·SDS-PAGE样品的制备 | 第43-44页 |
| ·SDS-PAG和Western-blot电泳检测表达情况 | 第44-45页 |
| ·重组鹅干扰素抗病毒活性检测 | 第45-46页 |
| ·鹅胚成纤维细胞(GEF)的制备 | 第45页 |
| ·水泡性口炎病毒(VSV)的扩增与保存 | 第45页 |
| ·VSV的滴定 | 第45-46页 |
| ·鹅干扰素的抗病毒活性检测 | 第46页 |
| 3. 实验结果 | 第46-52页 |
| ·酵母转化子的PCR鉴定 | 第46-47页 |
| ·DOT-BLOT法筛选高表达菌株 | 第47-48页 |
| ·表达条件的优化 | 第48页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE分析 | 第48-49页 |
| ·表达产物的WESTERN-BLOT检测 | 第49-50页 |
| ·VSV效价的滴定(REED-MUENCH法) | 第50页 |
| ·GEF细胞内干扰素的抗病毒生物学活性 | 第50-52页 |
| 4.讨论 | 第52-56页 |
| ·转化方法的选取 | 第52页 |
| ·MUT~+酵母转化子的PCR筛选 | 第52-54页 |
| ·干扰素在毕赤酵母中的表达 | 第54-55页 |
| ·干扰素的抗病毒活性 | 第55-56页 |
| 第五章 全文结论 | 第56-57页 |
| 参考文献 | 第57-62页 |
| 致谢 | 第62页 |
