| 第一章 前言 | 第1-27页 |
| 1 GPX及其人工模拟 | 第11-18页 |
| ·GPX的结构与功能 | 第11-15页 |
| ·GPX的模拟 | 第15-18页 |
| 2 抗体酶 | 第18-19页 |
| 3 单链抗体 | 第19-20页 |
| ·单链抗体的结构 | 第19页 |
| ·单链抗体的应用 | 第19-20页 |
| 4 硒代半胱氨酸的生物合成 | 第20-23页 |
| ·硒代半胱氨酸的掺入机制 | 第20-21页 |
| ·原核生物的硒代半胱氨酸插入元件 | 第21-23页 |
| ·硒蛋白的原核表达 | 第23页 |
| 5 外源基因在大肠杆菌中高效表达的策略 | 第23-26页 |
| ·高效表达载体的构建 | 第24-25页 |
| ·转录调控 | 第25页 |
| ·翻译调控 | 第25-26页 |
| 6 本论文的设计目的 | 第26-27页 |
| 第二章 含有硒代半胱氨酸的单链抗体以包涵体形式在E.coli中表达 | 第27-60页 |
| 第一节 目的基因在表达载体pET21a(+)中的构建 | 第27-46页 |
| 1 实验材料 | 第27-29页 |
| ·主要试剂 | 第27-28页 |
| ·菌株与质粒 | 第28页 |
| ·培养基及缓冲液 | 第28-29页 |
| ·主要仪器 | 第29页 |
| 2 实验方法 | 第29-33页 |
| ·质粒的提取 | 第29页 |
| ·目的基因的获得 | 第29-30页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳 | 第30页 |
| ·DNA片段的回收 | 第30页 |
| ·限制性酶切酶消化DNA | 第30-31页 |
| ·酶切产物的连接 | 第31页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第31-32页 |
| ·连接产物的转化 | 第32页 |
| ·阳性克隆的筛选及其鉴定 | 第32页 |
| ·重组质粒及其菌种的保存 | 第32-33页 |
| 3 结果分析 | 第33-43页 |
| ·重组质粒pEF的构建 | 第33-39页 |
| ·目的基因片段EF的扩增 | 第33页 |
| ·PCR产物的酶切鉴定 | 第33-34页 |
| ·载体pET21a(+)的酶切鉴定 | 第34-35页 |
| ·载体和目的基因的双酶切 | 第35页 |
| ·连接反应 | 第35-36页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第36-39页 |
| ·重组质粒pEFS的构建 | 第39-41页 |
| ·目的基因片段EFS的扩增 | 第39-40页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第40-41页 |
| ·重组质粒pEFT 和pEFTS的构建 | 第41-43页 |
| ·目的基因片段EFT和EFTS的扩增 | 第41-42页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第42-43页 |
| 4 讨论 | 第43-46页 |
| ·突变点的选择 | 第43-44页 |
| ·利用聚合酶链式反应(PCR)技术获得目的基因 | 第44-46页 |
| 第二节 含有硒代半胱氨酸的单链抗体基因的表达 | 第46-60页 |
| 1 实验材料 | 第46-48页 |
| ·主要试剂 | 第46页 |
| ·实验仪器 | 第46-47页 |
| ·主要溶液的配制 | 第47-48页 |
| 2 实验方法 | 第48-52页 |
| ·转化 | 第48页 |
| ·pE系列质粒的转化 | 第48页 |
| ·pE 系列质粒与pSU质粒的共转化 | 第48页 |
| ·工程菌的诱导表达 | 第48-50页 |
| ·菌株BL21(DE3)-pEFS/pSU、BL21(DE3)-pEF/pSU和BL21(DE3)-pE/pSU的诱导表达 | 第48-49页 |
| ·工程菌BL21(DE3)-pEFS诱导表达条件的优化 | 第49-50页 |
| ·菌株BL21(DE3)-pEFT/pSU和BL21(DE3)-pEFTS/pSU的诱导表达 | 第50页 |
| ·工程菌BL21(DE3)-pE/pSU系列表达产物的分离纯化 | 第50-51页 |
| ·表达产物的鉴定 | 第51-52页 |
| ·蛋白质免疫印迹(Western Blot) | 第51-52页 |
| ·75Se放射性自显影(75Se labeling) | 第52页 |
| 3 结果与讨论 | 第52-60页 |
| ·pE 系列质粒与pSU质粒的共转化 | 第52-53页 |
| ·工程菌的诱导表达 | 第53-56页 |
| ·工程菌BL21(DE3)-pEF和BL21(DE3)-pEFS诱导表达的结果 | 第53页 |
| ·工程菌BL21(DE3)-pEFS诱导表达条件的优化 | 第53-56页 |
| ·菌株BL21(DE3)-pEFT/pSU和BL21(DE3)-pEFTS/pSU的诱导表达 | 第56页 |
| ·BL21(DE3)-pEFTS/pSU表达产物的分离纯化 | 第56页 |
| ·表达产物的鉴定 | 第56-60页 |
| ·工程菌 BL21(DE3)-pE/pSU系列诱导表达产物的Western Blot鉴定 | 第56-58页 |
| ·75Se放射性自显影鉴定表达产物 | 第58-60页 |
| 第三章 含有硒代半胱氨酸的单链抗体与谷胱甘肽硫转移酶的融合表达 | 第60-71页 |
| 第一节 目的基因在表达载体pGEX-2T中的构建 | 第61-65页 |
| 1 实验材料 | 第61页 |
| 2 实验方法 | 第61-62页 |
| 3 结果与讨论 | 第62-65页 |
| ·目的基因片段GF、GFS、GFT和GFTS的扩增 | 第62页 |
| ·PCR产物的酶切鉴定 | 第62-63页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第63-65页 |
| ·阳性克隆的酶切鉴定 | 第63-64页 |
| ·测序鉴定 | 第64-65页 |
| 第二节 含有硒代半胱氨酸的单链抗体与谷胱甘肽硫转移酶的融合表达 | 第65-71页 |
| 1 实验材料 | 第65页 |
| 2 实验方法 | 第65-66页 |
| ·pG系列质粒与pSU质粒的共转化 | 第65页 |
| ·工程菌BL21(DE3)-pG/pSU系列的诱导表达 | 第65页 |
| ·工程菌BL21(DE3)-pG/pSU系列表达产物的分离纯化 | 第65-66页 |
| ·Glutathione Sepharose 4B亲和柱料的处理 | 第65页 |
| ·融合蛋白的分离纯化 | 第65-66页 |
| ·表达产物的鉴定 | 第66页 |
| 3 结果与讨论 | 第66-71页 |
| ·pG系列质粒与pSU质粒的共转化 | 第66页 |
| ·工程菌BL21(DE3)-pG/pSU系列的诱导表达 | 第66-67页 |
| ·工程菌BL21(DE3)-pGFTS/pSU表达产物的分离纯化 | 第67-69页 |
| ·BL21(DE3)-pG/pSU系列工程菌表达产物的75Se放射性自显影鉴定 | 第69-71页 |
| 参考文献 | 第71-77页 |
| 中文摘要 | 第77-79页 |
| ABSTRACT | 第79-82页 |
| 附录 | 第82-91页 |
| 致谢 | 第91页 |
