| 中文摘要 | 第1-12页 |
| 英文摘要 | 第12-14页 |
| 绪论 | 第14-24页 |
| 第一章 Procaspase-3蛋白在大肠杆菌中的诱导表达与分离纯化 | 第24-41页 |
| 前言 | 第24-25页 |
| 第一节 实验材料与方法 | 第25-32页 |
| 1 实验材料与仪器 | 第25-26页 |
| 2 实验方法 | 第26-32页 |
| ·表达质粒pET-21b-Tag_((His))-CPP32的优化构建 | 第26-28页 |
| ·双酶切获得目的基因CPP32片段 | 第26-27页 |
| ·表达载体pET-21b(+)的制备 | 第27页 |
| ·表达载体pET-21b(+)的双酶切 | 第27-28页 |
| ·连接 | 第28页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 | 第28页 |
| ·用氯化钙制备大肠杆菌感受态细胞 | 第28页 |
| ·热转化大肠杆菌感受态细胞 | 第28页 |
| ·含重组质粒的细菌菌落的鉴定 | 第28页 |
| ·重组pET-21b-Tag(His)-CPP32的表达验证及可溶性分析 | 第28-30页 |
| ·表达及可溶性分析 | 第28-29页 |
| ·SDS-PAGE电泳 | 第29-30页 |
| ·目的蛋白的诱导表达与分离纯化 | 第30-32页 |
| ·目的蛋白的实验室规模发酵制备 | 第30页 |
| ·Ni-NTA Sepharose Fast Flow柱层析 | 第30-31页 |
| ·过柱洗脱液的超滤与冻干 | 第31-32页 |
| 第二节 实验结果 | 第32-38页 |
| 1 表达质粒pET-21b-Tag_((His))-CPP32构建 | 第32-34页 |
| ·表达质粒pET-21b-Tag_((His))-CPP32构建流程设计 | 第32-33页 |
| ·提取质粒后对阳性重组子的验证 | 第33-34页 |
| ·菌落菌种保藏后,以T7 promoter为引物测序 | 第34页 |
| 2 对阳性克隆重组子的诱导表达验证及可溶性分析 | 第34-35页 |
| 3 Ni-NTA Sepharose Fast Flow柱层析及电泳分析结果 | 第35-38页 |
| 第三节 讨论 | 第38-40页 |
| 小结 | 第40-41页 |
| 第二章 建立高通量体外比色法筛选平台 | 第41-59页 |
| 前言 | 第41-43页 |
| 第一节 实验材料与方法 | 第43-48页 |
| 1 实验材料与仪器 | 第43-44页 |
| 2 实验方法 | 第44-48页 |
| ·蛋白质含量测定—Lowry法 | 第44页 |
| ·配制各缓冲液 | 第44页 |
| ·准备各试剂贮存液 | 第44-45页 |
| ·备样 | 第45页 |
| ·分组与加样 | 第45-46页 |
| ·检测 | 第46页 |
| ·数据分析 | 第46页 |
| ·HL-60细胞提取蛋白的比色法检测 | 第46-48页 |
| 第二节 实验结果 | 第48-57页 |
| 1 蛋白质含量测定 | 第48页 |
| 2 比色法基本组OD值-T曲线与方法评价(Z’因子考察)及组间差异统计 | 第48-50页 |
| 3 求caspase-3酶活力 | 第50-51页 |
| 4 细胞内提取caspase-3蛋白的活性检测 | 第51-53页 |
| 5 不同浓度PAC-1对rch-procaspase-3的体外活化作用 | 第53-55页 |
| 6 底物的灵敏、有效性 | 第55-57页 |
| 第三节 讨论 | 第57-58页 |
| 小结 | 第58-59页 |
| 第三章 高通量比色法的初步应用及Western Blotting检测辅助验证靶点等 | 第59-74页 |
| 前言 | 第59-60页 |
| 第一节 实验材料与方法 | 第60-65页 |
| 1 实验材料与仪器 | 第60-61页 |
| 2 实验方法 | 第61-65页 |
| ·Western blot analysis(免疫印迹法) | 第61-63页 |
| ·工作液的配制 | 第61-62页 |
| ·蛋白质电泳 | 第62页 |
| ·免疫印迹 | 第62-63页 |
| ·20种PAC-1衍生物的溶解 | 第63页 |
| ·给药处理HL-60细胞 | 第63页 |
| ·MTT法检测 | 第63-64页 |
| ·MTT法的基本原理 | 第63-64页 |
| ·MTT法的测定方法 | 第64页 |
| ·统计方法 | 第64-65页 |
| 第二节 实验结果 | 第65-72页 |
| 1 比色法对20种化合物的筛选结果与分析 | 第65-69页 |
| 2 Western Blotting法对化合物WF-210对procaspase-3活化作用的确认 | 第69-70页 |
| 3 HL-60水平对20种PAC-1衍生物的筛选与分析 | 第70-72页 |
| 第三节 讨论 | 第72-73页 |
| 小结 | 第73-74页 |
| 结论 | 第74-75页 |
| 参考文献 | 第75-82页 |
| 致谢 | 第82页 |
