| 中文摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-12页 |
| 文献综述 | 第12-24页 |
| 1 核盘菌概述 | 第12-14页 |
| ·核盘菌生物学特性 | 第12页 |
| ·核盘菌形态特征 | 第12-14页 |
| ·菌核病的防治 | 第14页 |
| 2 交配型基因概述 | 第14-16页 |
| ·子囊菌交配系统的基本特征 | 第14-15页 |
| ·子囊菌交配型基因的结构 | 第15页 |
| ·子囊菌交配型基因的功能 | 第15-16页 |
| ·子囊菌交配型的识别与转导 | 第16页 |
| ·核盘菌有性生殖现状 | 第16页 |
| 3 Real Time PCR 检测表达量的研究 | 第16-19页 |
| ·Real Time PCR 的原理 | 第16-17页 |
| ·Real Time PCR 的检测方法 | 第17-18页 |
| ·Real Time PCR 的定量方法 | 第18页 |
| ·Real Time PCR 的应用 | 第18-19页 |
| 4 丝状真菌遗传转化 | 第19-22页 |
| ·丝状真菌转化的方法 | 第19页 |
| ·PEG-CaCl_2法介导转化的研究进展 | 第19-20页 |
| ·PEG-CaCl_2介导原生质体转化概述 | 第20页 |
| ·原生质体的制备是 PEG-CaCl_2转化的关键 | 第20-21页 |
| ·PEG-CaCl_2法转化的优缺点 | 第21页 |
| ·PEG-CaCl_2法转化的意义及应用 | 第21-22页 |
| 5 研究目的及意义 | 第22-24页 |
| 第一章 核盘菌 MAT-2 基因的克隆、序列分析及原核表达 | 第24-45页 |
| 1 材料 | 第24-25页 |
| ·菌株及载体 | 第24页 |
| ·主要试剂 | 第24页 |
| ·主要试剂配制 | 第24-25页 |
| ·主要实验仪器 | 第25页 |
| 2 方法 | 第25-34页 |
| ·MAT-2 基因的克隆 | 第25-29页 |
| ·MAT-2 基因的生物信息学分析 | 第29-30页 |
| ·原核表达载体的构建 | 第30-31页 |
| ·原核表达载体的鉴定 | 第31-32页 |
| ·重组质粒 pET-28a::M 转入 E.coli BL21 | 第32页 |
| ·诱导表达蛋白 | 第32-33页 |
| ·SDS-PAGE 电泳检测 | 第33-34页 |
| 3 结果与分析 | 第34-43页 |
| ·反转录 PCR 克隆 MAT-2 基因结果 | 第34页 |
| ·重组 pMD18-T::M 质粒 PCR 和酶切鉴定结果 | 第34-36页 |
| ·序列分析 | 第36-41页 |
| ·重组质粒 pET-28a:: MAT-2 PCR 和酶切鉴定结果 | 第41-42页 |
| ·原核表达 MAT-2 基因编码的蛋白 | 第42-43页 |
| 4 讨论 | 第43-45页 |
| 第二章 Real Time PCR检测核盘菌MAT-2交配型基因的表达动态 | 第45-53页 |
| 1 材料 | 第45页 |
| ·菌株 | 第45页 |
| ·主要试剂 | 第45页 |
| ·主要仪器 | 第45页 |
| ·培养基 | 第45页 |
| 2 方法 | 第45-47页 |
| ·菌核及子囊盘各时期样本的获得 | 第45-46页 |
| ·核盘菌总 RNA 提取方法 | 第46页 |
| ·引物的设计及扩增条件 | 第46页 |
| ·核盘菌 cDNA 的定量及目的基因与管家基因间的效率检测 | 第46-47页 |
| ·采用 ΔΔCt 法检测各个时期 MAT-2 基因的表达差异 | 第47页 |
| 3 结果与分析 | 第47-51页 |
| ·菌核及子囊盘各个时期样本的获得 | 第47-48页 |
| ·引物扩增的特异性检测 | 第48-49页 |
| ·采用相对定量 PCR 的方法检测不同时期核盘菌中 MAT-2 基因的表达量 | 第49-51页 |
| 4 讨论 | 第51-53页 |
| 第三章 建立 PEG-CaCl_2介导核盘菌原生质体遗传转化体系及MAT-2 基因的功能验证 | 第53-86页 |
| 1 材料 | 第53-54页 |
| ·菌株及载体 | 第53页 |
| ·酶和主要试剂 | 第53页 |
| ·主要试剂配制 | 第53-54页 |
| ·主要实验仪器 | 第54页 |
| 2 方法 | 第54-66页 |
| ·核盘菌 MAT-2 基因左右臂的克隆 | 第54-58页 |
| ·潮霉素基因的克隆 | 第58-59页 |
| ·利用 overlapping PCR 构建转化片段 | 第59-61页 |
| ·核盘菌菌丝原生质体的制备 | 第61-62页 |
| ·利用 PEG-CaCl_2介导核盘菌原生质体遗传转化 | 第62页 |
| ·敲除转化子的筛选 | 第62页 |
| ·敲除转化子的 PCR 验证 | 第62-65页 |
| ·敲除体转化子的生物学特性分析 | 第65-66页 |
| ·敲除 MAT-2 转化子致病性分析 | 第66页 |
| ·不产菌核转化子的生物学特性分析和致病性分析 | 第66页 |
| 3 结果与分析 | 第66-84页 |
| ·鉴定核盘菌基因组 DNA | 第66页 |
| ·核盘菌交配型基因左臂、右臂序列的 PCR 扩增结果 | 第66-67页 |
| ·核盘菌 MAT-2 交配型基因左臂和右臂回收结果 | 第67-68页 |
| ·重组 pMD18-T::R 和 pMD18-T::L 质粒 PCR 鉴定 | 第68-69页 |
| ·重组质粒 pMD18-T::R 和 pMD18-T::L 的序列测定 | 第69页 |
| ·潮霉素基因片段 hy 和 yg 的 PCR 扩增结果 | 第69-70页 |
| ·利用 overlapping PCR 构建敲除转化片段 | 第70-71页 |
| ·制备核盘菌菌丝体的原生质体 | 第71-72页 |
| ·验证获得的转化子 | 第72-77页 |
| ·敲除体转化子的生物学特性分析 | 第77-81页 |
| ·敲除 MAT-2 转化子的致病性分析 | 第81-82页 |
| ·不产菌核转化子的形态特征 | 第82-83页 |
| ·不产菌核转化子致病性分析 | 第83-84页 |
| 4 讨论 | 第84-86页 |
| 结论 | 第86-87页 |
| 参考文献 | 第87-93页 |
| 致谢 | 第93页 |
