| 摘要 | 第1-16页 |
| Abstract | 第16-19页 |
| 主要英文缩写与译名 | 第19-20页 |
| 引言 | 第20-22页 |
| 第一章 文献综述 | 第22-59页 |
| 第一节 纤维素与纤维素酶 | 第22-43页 |
| 1 纤维素的特性 | 第22-25页 |
| ·纤维素的理化性质 | 第22-24页 |
| ·纤维素的分布 | 第24页 |
| ·纤维素的降解 | 第24-25页 |
| 2 纤维素酶的来源及其酶学性质 | 第25-29页 |
| ·纤维素酶的来源 | 第25-27页 |
| ·纤维素酶的酶学性质 | 第27-29页 |
| 3 纤维素酶的组成、结构及其降解机理 | 第29-34页 |
| ·纤维素酶的组成 | 第29-30页 |
| ·纤维素酶的结构 | 第30-31页 |
| ·纤维素酶的作用机制 | 第31-34页 |
| 4 纤维素酶产生菌的选育 | 第34-37页 |
| ·自然筛选 | 第34-35页 |
| ·常规理化诱变 | 第35页 |
| ·基因工程 | 第35-36页 |
| ·基因定位突变技术 | 第36-37页 |
| ·细胞融合技术 | 第37页 |
| 5 纤维素酶基因的克隆与表达 | 第37-39页 |
| 6 纤维素酶的应用 | 第39-43页 |
| ·纤维素酶在纺织工业中的应用 | 第39页 |
| ·纤维素酶在食品工业中的应用 | 第39-40页 |
| ·纤维素酶在酿酒工业中的应用 | 第40页 |
| ·纤维素酶在造纸工业中的应用 | 第40-41页 |
| ·纤维素酶在饲料工业中的应用 | 第41-42页 |
| ·纤维素酶在医药工业中的应用 | 第42页 |
| ·纤维素酶在其他领域中的应用 | 第42-43页 |
| 第二节 杆状病毒表达系统 | 第43-51页 |
| 1 杆状病毒的生物学特性 | 第43-45页 |
| 2 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的建立及发展 | 第45-47页 |
| 3 家蚕BmNPV/Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的优缺点 | 第47-49页 |
| 4 家蚕BmNPV/Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的应用前景 | 第49-51页 |
| 第三节 家蚕转基因 | 第51-56页 |
| 1 转基因方法 | 第51-52页 |
| 2 转基因载体 | 第52-54页 |
| 3 常用报告基因与启动子 | 第54-55页 |
| 4 转基因家蚕的表达检测 | 第55页 |
| 5 家蚕转基因的应用及存在问题 | 第55-56页 |
| 第四节 本研究的主要内容及意义 | 第56-58页 |
| 第五节 技术路线 | 第58-59页 |
| 第二章 研究工作报告 | 第59-148页 |
| 第一节 纤维素酶产生菌的筛选、鉴定及特性分析 | 第59-85页 |
| 1 实验材料 | 第59-63页 |
| ·土壤 | 第59页 |
| ·克隆宿主菌 | 第59-60页 |
| ·主要试剂及其配制 | 第60-63页 |
| ·试剂盒 | 第63页 |
| ·DNA测序 | 第63页 |
| ·主要实验仪器 | 第63页 |
| 2 实验方法 | 第63-73页 |
| ·菌种筛选 | 第63-64页 |
| ·刚果红染色 | 第64页 |
| ·菌种保存 | 第64页 |
| ·纤维素酶的制备 | 第64页 |
| ·酶活性测定 | 第64-66页 |
| ·蛋白质浓度测定 | 第66页 |
| ·酶特性分析 | 第66-68页 |
| ·16S rRNA、ITS及纤维素酶基因序列分析 | 第68-73页 |
| ·统计分析 | 第73页 |
| 3 实验结果 | 第73-82页 |
| ·纤维素酶产生菌的分离 | 第73页 |
| ·菌种鉴定 | 第73-78页 |
| ·筛选菌分泌的纤维素酶特性 | 第78-80页 |
| ·纤维素酶基因序列分析 | 第80-82页 |
| 4 讨论 | 第82-85页 |
| 第二节 微波与紫外复合诱变提高绿色木霉纤维素酶活性 | 第85-97页 |
| 1 实验材料 | 第85-87页 |
| ·实验菌种 | 第85页 |
| ·克隆宿主菌 | 第85页 |
| ·主要试剂及其配制 | 第85-86页 |
| ·试剂盒 | 第86页 |
| ·DNA测序 | 第86页 |
| ·主要试验仪器 | 第86-87页 |
| 2 实验方法 | 第87-90页 |
| ·菌种培养 | 第87页 |
| ·酶液提取、酶活测定及酶特性分析 | 第87-88页 |
| ·单孢子悬浮液的制备 | 第88页 |
| ·微波处理 | 第88页 |
| ·紫外处理 | 第88页 |
| ·绿色木霉突变株的筛选 | 第88页 |
| ·突变菌株的遗传稳定性研究 | 第88页 |
| ·纤维素酶基因的分析 | 第88-90页 |
| ·统计分析 | 第90页 |
| 3 实验结果 | 第90-96页 |
| ·CMCase的特性 | 第90-91页 |
| ·绿色木霉的突变及突变株的筛选 | 第91-92页 |
| ·突变株的纤维素酶活性及遗传稳定性 | 第92-93页 |
| ·纤维素酶基因的分析 | 第93-96页 |
| 4 讨论 | 第96-97页 |
| 第三节 绿色木霉内切葡聚糖酶基因的克隆及序列分析 | 第97-116页 |
| 1 实验材料 | 第97-98页 |
| ·实验菌种 | 第97页 |
| ·克隆宿主菌 | 第97页 |
| ·LB固体/液体培养基 | 第97-98页 |
| ·基因克隆用试剂 | 第98页 |
| ·试剂盒 | 第98页 |
| ·DNA测序 | 第98页 |
| ·主要试验仪器 | 第98页 |
| 2 实验方法 | 第98-104页 |
| ·绿色木霉基因组提取 | 第98页 |
| ·引物设计 | 第98-99页 |
| ·基因克隆 | 第99-104页 |
| ·测序及分析 | 第104页 |
| 3 实验结果 | 第104-114页 |
| ·绿色木霉基因组的提取 | 第104页 |
| ·EG Ⅰ基因的克隆及序列分析 | 第104-107页 |
| ·EG Ⅲ基因的克隆及序列分析 | 第107-109页 |
| ·EG Ⅳ基因的克隆及序列分析 | 第109-112页 |
| ·EG Ⅴ基因的克隆及序列分析 | 第112-114页 |
| 4 讨论 | 第114-116页 |
| 第四节 绿色木霉内切葡聚糖酶基因在家蚕中的表达 | 第116-135页 |
| 1 实验材料 | 第117-120页 |
| ·内切葡聚糖酶基因 | 第117页 |
| ·克隆载体 | 第117页 |
| ·克隆宿主菌 | 第117页 |
| ·表达宿主菌 | 第117页 |
| ·限制性内切酶 | 第117页 |
| ·试剂盒 | 第117-118页 |
| ·抗生素、显色剂及诱导剂 | 第118页 |
| ·家蚕细胞 | 第118页 |
| ·家蚕 | 第118页 |
| ·培养基 | 第118页 |
| ·SDS-PAGE主要试剂及其配制 | 第118-119页 |
| ·Western blotting主要试剂配制 | 第119-120页 |
| 2 实验方法 | 第120-129页 |
| ·克隆与表达策略 | 第120页 |
| ·引物设计 | 第120-121页 |
| ·PCR扩增 | 第121-122页 |
| ·双酶切 | 第122-123页 |
| ·目的片段与克隆载体的连接 | 第123页 |
| ·热激转化感受态细胞的制备 | 第123页 |
| ·连接产物转化E.coli TG 1感受态细胞 | 第123页 |
| ·含pFast重组质粒的阳性克隆子的鉴定 | 第123页 |
| ·pFast重组质粒的提取 | 第123-124页 |
| ·pFast重组质粒转化DH10Bac~(TM) E.coli | 第124页 |
| ·mBacmid重组质粒的提取 | 第124页 |
| ·含mBacmid重组质粒的阳性克隆子的鉴定 | 第124-125页 |
| ·家蚕细胞的培养 | 第125页 |
| ·家蚕的饲养 | 第125页 |
| ·mBacmid重组杆状病毒的构建 | 第125-126页 |
| ·重组内切葡聚糖酶基因的表达 | 第126页 |
| ·Western blotting | 第126-128页 |
| ·酶液提取与活性检测 | 第128页 |
| ·酶特性分析及统计处理 | 第128-129页 |
| 3 实验结果 | 第129-134页 |
| ·重组病毒质粒的构建 | 第129-130页 |
| ·重组病毒的构建 | 第130-131页 |
| ·在家蚕细胞和幼虫中表达重组内切葡聚糖酶基因 | 第131-132页 |
| ·酶活性分析 | 第132-134页 |
| 4 讨论 | 第134-135页 |
| 第五节 纤维素酶转基因载体的构建及细胞转染 | 第135-148页 |
| 1 实验材料 | 第135-137页 |
| ·克隆宿主菌 | 第135页 |
| ·重组质粒 | 第135-136页 |
| ·限制性内切酶 | 第136页 |
| ·PCR试剂盒、割胶回收试剂盒以及连接试剂盒 | 第136页 |
| ·质粒抽提试剂盒 | 第136页 |
| ·引物设计 | 第136页 |
| ·培养基 | 第136-137页 |
| ·抗生素 | 第137页 |
| 2 实验方法 | 第137-142页 |
| ·构建策略 | 第137页 |
| ·质粒抽提 | 第137-138页 |
| ·IE-EG Ⅳ-SV40的克隆 | 第138-139页 |
| ·IE-GFP-SV40的克隆 | 第139页 |
| ·IE-EG Ⅳ-SV40与IE-GFP-SV40的末端加A反应克隆 | 第139页 |
| ·IE-EG Ⅳ-SV40与IE-GFP-SV40的TA克隆 | 第139-140页 |
| ·IE-Neo-SV40的克隆 | 第140页 |
| ·IE-EG Ⅳ-SV40与pXL-Bac Ⅱ的BglⅡ/Kpn Ⅰ双酶切 | 第140页 |
| ·IE-EG Ⅳ-SV40与pXL-Bac Ⅱ的连接 | 第140页 |
| ·IE-EG Ⅳ-SV40与pXL-Bac Ⅱ连接产物的转化及PCR鉴定 | 第140页 |
| ·IE-GFP-SV40与pXL/EG Ⅳ的Xho Ⅰ/EcoR Ⅴ双酶切 | 第140页 |
| ·IE-GFP-SV40与pXL/EG Ⅳ的连接 | 第140-141页 |
| ·IE-GFP-SV40与pXL/EG Ⅳ连接产物的转化及PCR鉴定 | 第141页 |
| ·pXL/EG Ⅳ/GFP EcoR Ⅰ单酶切 | 第141页 |
| ·pXL/EG Ⅳ/GFP EcoR Ⅰ单酶切回收产物的去磷酸化处理 | 第141页 |
| ·pXL/EG Ⅳ/GFP与IE-Neo-SV40的连接 | 第141页 |
| ·pXL/EG Ⅳ/GFP与IE-Neo-SV40连接产物的转化及酶切鉴定 | 第141页 |
| ·家蚕细胞的培养 | 第141页 |
| ·细胞转染 | 第141-142页 |
| 3 实验结果 | 第142-145页 |
| ·IE-EG Ⅳ-SV40和IE-GFP-SV40的克隆 | 第142-143页 |
| ·IE-EG Ⅳ-SV40与pXL-Bac Ⅱ的Bgl Ⅱ/Kpn Ⅰ双酶切及其连接 | 第143页 |
| ·IE-GFP-SV40与pXL/EG Ⅳ的Xho Ⅰ/EcoR Ⅴ双酶切及其连接 | 第143-144页 |
| ·IE-Neo-SV40与pXL/EG Ⅳ/GFP的EcoR Ⅰ单酶切及其连接 | 第144-145页 |
| ·细胞的瞬时转染与稳定转染 | 第145页 |
| 4 讨论 | 第145-148页 |
| 第三章 主要结论、创新点及后续研究展望 | 第148-150页 |
| 1. 主要结论 | 第148-149页 |
| 2. 创新点 | 第149页 |
| 3. 后续研究展望 | 第149-150页 |
| 参考文献 | 第150-172页 |
| 附录 | 第172-173页 |
| 发表论文 | 第173-177页 |
| 授权国家发明专利 | 第177-178页 |
| 基因登录 | 第178页 |
| 参与或主持的课题 | 第178-179页 |
| 国际交流及会议 | 第179-180页 |
| 后记 | 第180页 |
