| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 中英文符号对照表 | 第14-15页 |
| 第1章 前言 | 第15-41页 |
| 1.1 研究意义 | 第15-16页 |
| 1.2 研究背景 | 第16-36页 |
| 1.2.1 抗血管生成 | 第16-18页 |
| 1.2.2 Kal 结构与功能 | 第18-27页 |
| 1.2.2.1 Kal 结构与分布 | 第18-22页 |
| 1.2.2.2 Kal 细胞膜结合蛋白 | 第22-23页 |
| 1.2.2.3 Kal 功能研究 | 第23-27页 |
| 1.2.3 核仁素的结构与功能 | 第27-32页 |
| 1.2.3.1 核仁素的结构特点 | 第27-28页 |
| 1.2.3.2 核仁素的细胞定位和穿梭特性 | 第28页 |
| 1.2.3.3 核仁素的功能 | 第28-32页 |
| 1.2.4 整合素的功能 | 第32-34页 |
| 1.2.4.1 整合素与肿瘤的血管生成 | 第33页 |
| 1.2.4.2 整合素与肿瘤转移 | 第33-34页 |
| 1.2.5 蛋白相互作用的研究方法 | 第34-36页 |
| 1.2.5.1 酵母双杂交法 | 第34-35页 |
| 1.2.5.2 免疫共沉淀技术 | 第35-36页 |
| 1.2.5.3 双分子荧光互补技术 | 第36页 |
| 1.3 研究内容 | 第36-37页 |
| 1.4 研究方法 | 第37-38页 |
| 1.4.1 Kal 抗血管生成活性分析 | 第37页 |
| 1.4.2 Kal 细胞膜受体的分离、鉴定 | 第37页 |
| 1.4.3 细胞膜结合蛋白在 Kal 抗肿瘤活性中的影响 | 第37-38页 |
| 1.4.4 整合素β3 介导 Kal 发挥抗肿瘤活性 | 第38页 |
| 1.5 论文结构 | 第38-41页 |
| 1.5.1 引言 | 第38页 |
| 1.5.2 Kal 抗血管生成作用 | 第38页 |
| 1.5.3 Kal 细胞膜受体的分离与鉴定 | 第38页 |
| 1.5.4 Nucleolin 在 Kal 抗肿瘤活性中的作用 | 第38页 |
| 1.5.5 整合素β3 介导 Kal 抗肿瘤活性 | 第38-41页 |
| 第2章 rhKal 的表达、纯化和抗血管生成活性 | 第41-67页 |
| 2.1 实验材料 | 第41-44页 |
| 2.1.1 实验质粒、菌株和细胞株 | 第41页 |
| 2.1.2 实验试剂 | 第41-42页 |
| 2.1.3 试剂配制 | 第42-43页 |
| 2.1.4 实验仪器 | 第43-44页 |
| 2.2 实验方法 | 第44-53页 |
| 2.2.1 rhKal 的表达、纯化与鉴定 | 第44-47页 |
| 2.2.2 rhKal(his)的表达、纯化与鉴定 | 第47-48页 |
| 2.2.3 Western Blotting | 第48-50页 |
| 2.2.4 HUVEC 细胞活力的检测——MTT 法 | 第50页 |
| 2.2.5 HUVEC 细胞增殖活性的检测—— Edu 法 | 第50-51页 |
| 2.2.6 HUVEC 细胞小管形成 | 第51页 |
| 2.2.7 HUVEC 细胞迁移的检测—— Transwell 法 | 第51-52页 |
| 2.2.8 HUVEC 细胞迁移的检测——划痕实验 | 第52页 |
| 2.2.9 HUVEC 细胞克隆的形成 | 第52页 |
| 2.2.10 HUVEC 细胞凋亡的检测—— Annexin V-PI 双染 | 第52-53页 |
| 2.2.11 HUVEC 细胞凋亡的检测——Hoechst 33258 染色 | 第53页 |
| 2.2.12 数据统计 | 第53页 |
| 2.3 实验结果 | 第53-66页 |
| 2.3.1 重组质粒 pPIC-9-Kal 的鉴定 | 第53-54页 |
| 2.3.2 rhKal 蛋白的鉴定 | 第54-55页 |
| 2.3.3 rhKal 蛋白的纯化 | 第55-56页 |
| 2.3.4 重组质粒 pPIC-9-Kal(his)鉴定 | 第56-57页 |
| 2.3.5 rhKal-his 蛋白的鉴定 | 第57页 |
| 2.3.6 rhKal-his 蛋白的纯化 | 第57-58页 |
| 2.3.7 rhKal 对 HUVEC 细胞活力的影响 | 第58页 |
| 2.3.8 rhKal 抑制 HUVEC 细胞增殖 | 第58-60页 |
| 2.3.9 rhKal 抑制 HUVEC 小管形成 | 第60-61页 |
| 2.3.10 rhKal 抑制 HUVEC 的迁移 | 第61-63页 |
| 2.3.11 rhKal 抑制 HUVEC 集落形成 | 第63页 |
| 2.3.12 rhKal 诱导 HUVEC 细胞凋亡 | 第63-65页 |
| 2.3.13 Caspase 激活介导 rhKal 诱导 HUVEC 凋亡 | 第65-66页 |
| 2.4 小结 | 第66-67页 |
| 第3章 Kal 膜结合蛋白的分离与鉴定 | 第67-79页 |
| 3.1 实验材料 | 第67-68页 |
| 3.1.1 实验细胞株 | 第67页 |
| 3.1.2 实验试剂 | 第67-68页 |
| 3.1.3 实验仪器 | 第68页 |
| 3.2 实验方法 | 第68-72页 |
| 3.2.1 细胞膜蛋白提取 | 第68-69页 |
| 3.2.2 Pull-Down 方法 | 第69页 |
| 3.2.3 免疫共沉淀 | 第69-70页 |
| 3.2.4 测定蛋白浓度—— BCA 法 | 第70-71页 |
| 3.2.5 细胞免疫荧光 | 第71-72页 |
| 3.3 实验结果 | 第72-77页 |
| 3.3.1 Pull-Down 技术分离 Kal 膜结合蛋白 | 第72页 |
| 3.3.2 LC-MS／MS 技术鉴定 Kal 膜结合蛋白 | 第72-74页 |
| 3.3.3 免疫共沉淀方法鉴定 Kal 膜结合蛋白 | 第74-75页 |
| 3.3.4 免疫荧光实验结果 | 第75-77页 |
| 3.4 小结 | 第77-79页 |
| 第4章 核仁素介导 rhKal 体外抗血管生成作用 | 第79-93页 |
| 4.1 实验材料 | 第79-80页 |
| 4.1.1 实验细胞株 | 第79页 |
| 4.1.2 实验试剂 | 第79-80页 |
| 4.1.3 实验仪器 | 第80页 |
| 4.2 实验方法 | 第80-82页 |
| 4.2.1 siRNA 转染 | 第80-81页 |
| 4.2.2 HUVEC 细胞活力 | 第81页 |
| 4.2.3 HUVEC 细胞迁移—— Transwell 法 | 第81页 |
| 4.2.4 流式细胞仪检测细胞膜上核仁素分布 | 第81-82页 |
| 4.2.5 流式细胞仪检测细胞中 rhKal | 第82页 |
| 4.3 实验结果 | 第82-91页 |
| 4.3.1 siRNA 对 Kal 膜结合蛋白的沉默效果评价 | 第82-84页 |
| 4.3.2 Kal 膜结合蛋白介导 rhKal 对 HUVEC 活力的抑制 | 第84-85页 |
| 4.3.3 核仁素、整合素β3 介导 rhKal 对 HUVEC 迁移的抑制 | 第85-87页 |
| 4.3.4 核仁素在 HUVEC 细胞中的表达与分布 | 第87-88页 |
| 4.3.5 核仁素介导 rhKal 入胞 | 第88-90页 |
| 4.3.6 rhKal 抑制核仁素磷酸化 | 第90-91页 |
| 4.4 小结 | 第91-93页 |
| 第5章 核仁素介导 rhKal 体内抗肿瘤活性 | 第93-107页 |
| 5.1 实验材料 | 第93-94页 |
| 5.1.1 实验细胞株与动物 | 第93页 |
| 5.1.2 实验试剂 | 第93页 |
| 5.1.3 仪器 | 第93-94页 |
| 5.2 实验方法 | 第94-96页 |
| 5.2.1 Hela 细胞裸鼠移植瘤模型 | 第94页 |
| 5.2.2 石蜡标本的制备 | 第94页 |
| 5.2.3 HE 染色 | 第94-95页 |
| 5.2.4 免疫组织化学检测 | 第95页 |
| 5.2.5 Tunel 法检测细胞凋亡 | 第95-96页 |
| 5.3 实验结果 | 第96-105页 |
| 5.3.1 核仁素介导 rhKal 的肿瘤生长抑制 | 第96-97页 |
| 5.3.2 肿瘤组织形态学观察 | 第97-98页 |
| 5.3.3 rhKal 抑制肿瘤组织中新生血管的形成 | 第98-100页 |
| 5.3.4 rhKal 降低肿瘤组织中 Ki67 的表达 | 第100-101页 |
| 5.3.5 rhKal 抑制肿瘤组织中 Hsp90 的表达 | 第101-102页 |
| 5.3.6 rhKal 诱导肿瘤组织细胞凋亡 | 第102-103页 |
| 5.3.7 rhKal 安全性的考察 | 第103-105页 |
| 5.4 小结 | 第105-107页 |
| 第6章 整合素β3 介导 rhKal 抗肿瘤分子机制 | 第107-131页 |
| 6.1 实验材料 | 第107-109页 |
| 6.1.1 实验细胞株与动物 | 第107页 |
| 6.1.2 实验试剂 | 第107-108页 |
| 6.1.3 试剂配制 | 第108页 |
| 6.1.4 实验仪器 | 第108-109页 |
| 6.2 实验方法 | 第109-113页 |
| 6.2.1 NCI-H446 细胞活力检测——MTT 法 | 第109页 |
| 6.2.2 NCI-H446 细胞增殖活性检测—— Edu 法 | 第109-110页 |
| 6.2.3 整合素β3 对 rhKal 抑制 NCI-H446 细胞活力的影响 | 第110页 |
| 6.2.4 NCI-H446 细胞迁移——划痕实验 | 第110页 |
| 6.2.5 NCI-H446 细胞迁移—— Transwell 法 | 第110-111页 |
| 6.2.6 NCI-H446 细胞凋亡检测—— Annexin V-PI 双染 | 第111页 |
| 6.2.7 NCI-H446 细胞凋亡检测——Hoechst 33258 染色 | 第111页 |
| 6.2.8 NCI-H446 细胞裸鼠移植瘤模型 | 第111-112页 |
| 6.2.9 石蜡标本的制备 | 第112页 |
| 6.2.10 HE 染色 | 第112页 |
| 6.2.11 免疫组织化学方法 | 第112-113页 |
| 6.2.12 Tunel 法检测细胞凋亡 | 第113页 |
| 6.3 实验结果 | 第113-129页 |
| 6.3.1 rhKal 抑制 NCI-H446 细胞活力 | 第113-114页 |
| 6.3.2 整合素β3 介导 rhKal 抑制 NCI-H446 细胞活力 | 第114-115页 |
| 6.3.3 rhKal 抑制 NCI-H446 细胞增殖 | 第115-116页 |
| 6.3.4 rhKal 抑制 NCI-H446 细胞迁移 | 第116-118页 |
| 6.3.5 rhKal 诱导 NCI-H446 细胞凋亡 | 第118-119页 |
| 6.3.6 rhKal 诱导 NCI-H446 细胞凋亡分子机制 | 第119-120页 |
| 6.3.7 rhKal 对整合素信号通路的影响 | 第120-122页 |
| 6.3.8 rhKal 抗肿瘤体内活性分析 | 第122-123页 |
| 6.3.9 肿瘤组织形态学观察 | 第123-124页 |
| 6.3.10 rhKal 抑制肿瘤组织中新生血管形成 | 第124页 |
| 6.3.11 rhKal 降低肿瘤组织中 Ki67 的表达 | 第124-125页 |
| 6.3.12 rhKal 降低肿瘤组织中 Hsp90 表达 | 第125-126页 |
| 6.3.13 rhKal 诱导肿瘤组织细胞凋亡 | 第126-127页 |
| 6.3.14 rhKal 安全性考察 | 第127-129页 |
| 6.4 小结 | 第129-131页 |
| 第7章 结论 | 第131-133页 |
| 7.1 主要工作 | 第131页 |
| 7.2 主要成果 | 第131-132页 |
| 7.3 创新点 | 第132-133页 |
| 参考文献 | 第133-141页 |
| 致谢 | 第141-143页 |
| 个人简历、发表的学术论文 | 第143页 |
