| 摘要 | 第9-10页 |
| Abstract | 第10-11页 |
| 1 前言 | 第12-25页 |
| 1.1 荔枝的营养价值及生产现状 | 第12页 |
| 1.2 荔枝酸腐病菌的研究概况 | 第12-14页 |
| 1.2.1 荔枝酸腐菌的简介 | 第12-13页 |
| 1.2.2 荔枝酸腐病防治的研究 | 第13-14页 |
| 1.3 丝状真菌遗传转化的研究进展 | 第14-20页 |
| 1.3.1 研究概况 | 第14页 |
| 1.3.2 选择标记 | 第14-16页 |
| 1.3.2.1 营养缺陷型标记 | 第14-15页 |
| 1.3.2.2 抗药性标记 | 第15-16页 |
| 1.3.3 原生质体的制备与再生 | 第16-18页 |
| 1.3.3.1 原生质体的制备 | 第16-17页 |
| 1.3.3.2 原生质体的再生 | 第17-18页 |
| 1.3.4 原生质体的转化 | 第18-20页 |
| 1.3.4.1 CaCl2-PEG转化方法 | 第18-19页 |
| 1.3.4.2 电激转化法 | 第19页 |
| 1.3.4.3 限制性内切酶介导转化法 | 第19-20页 |
| 1.4 GFP基因在真菌中应用的研究进展 | 第20-24页 |
| 1.4.1 GFP基因在真菌应用中的特点 | 第21页 |
| 1.4.2 GFP随机插入真菌基因组在真菌研究中的应用 | 第21-22页 |
| 1.4.3 GFP与目的基因融合在真菌分子生物学研究中的应用 | 第22-24页 |
| 1.5 本研究的目的和意义 | 第24-25页 |
| 2 荔枝酸腐菌菌丝产生条件的筛选 | 第25-33页 |
| 2.1 供试材料 | 第25页 |
| 2.2 供试培养基 | 第25页 |
| 2.3 实验方法 | 第25-26页 |
| 2.3.1 培养性状观察 | 第25页 |
| 2.3.2 培养基成分对病菌菌丝体生长的影响 | 第25页 |
| 2.3.3 温度对病菌菌丝体生长的影响 | 第25-26页 |
| 2.3.4 光照时间对病菌菌丝体生长的影响 | 第26页 |
| 2.3.5 pH对病菌菌丝体生长的影响 | 第26页 |
| 2.3.6 转速对病菌菌丝体生长的影响 | 第26页 |
| 2.3.7 培养时间对病菌菌丝体生长的影响 | 第26页 |
| 2.4 结果和分析 | 第26-31页 |
| 2.4.1 荔枝酸腐菌的形态学特征 | 第26-28页 |
| 2.4.2 不同培养基对病菌菌丝体生长的影响 | 第28页 |
| 2.4.3 温度对病菌菌丝体生长的影响 | 第28页 |
| 2.4.4 光照对病菌菌丝体生长的影响 | 第28-30页 |
| 2.4.5 pH对病菌菌丝体生长的影响 | 第30页 |
| 2.4.6 转速对病菌菌丝体生长的影响 | 第30-31页 |
| 2.4.7 培养时间对病菌菌丝体生长的影响 | 第31页 |
| 2.5 小结与讨论 | 第31-33页 |
| 3. 荔枝酸腐菌原生质体制备和再生条件的筛选 | 第33-46页 |
| 3.1 供试材料 | 第33页 |
| 3.2 供试培养基 | 第33页 |
| 3.3 供试试剂及配置方法 | 第33页 |
| 3.4 酶 | 第33页 |
| 3.5 实验方法 | 第33-36页 |
| 3.5.1 荔枝酸腐菌的培养 | 第33页 |
| 3.5.2 荔枝酸腐菌原生质体制备 | 第33-34页 |
| 3.5.3 菌丝菌龄对原生质体产量的影响 | 第34页 |
| 3.5.4 酶系组成对原生质体产量的影响 | 第34页 |
| 3.5.5 崩溃酶浓度对原生质体产量的影响 | 第34页 |
| 3.5.6 不同酶解温度对原生质体产量的影响 | 第34页 |
| 3.5.7 酶解时间对原生质体产量的影响 | 第34-35页 |
| 3.5.8 不同酶解转速对原生质体产量的影响 | 第35页 |
| 3.5.9 不同培养基对原生质体产量的影响 | 第35页 |
| 3.5.10 原生质体大小及形成方式的观察 | 第35页 |
| 3.5.11 渗透压稳定剂对原生质体的损耗率 | 第35页 |
| 3.5.12 荔枝酸腐菌原生质体再生 | 第35页 |
| 3.5.13 不同菌龄对原生质体再生的影响 | 第35-36页 |
| 3.5.14 酶反应时间对原生质体再生的影响 | 第36页 |
| 3.5.15 不同再生培养基对原生质体再生的影响 | 第36页 |
| 3.5.16 不同的渗透压稳定剂对原生质体再生的影响 | 第36页 |
| 3.5.17 原生质体再生的观察 | 第36页 |
| 3.6 结果与分析 | 第36-44页 |
| 3.6.1. 荔枝酸腐菌原生质体的制备 | 第36-42页 |
| 3.6.1.1 菌丝菌龄对原生质体产量的影响 | 第36-37页 |
| 3.6.1.2 酶系组成对原生质体产量的影响 | 第37-38页 |
| 3.6.1.3 崩溃酶浓度对原生质体产量的影响 | 第38页 |
| 3.6.1.4 不同酶解温度对原生质体产量的影响 | 第38页 |
| 3.6.1.5 不同酶解时间对原生质体产量的影响 | 第38-39页 |
| 3.6.1.6 不同培养基成分对原生质体产量的影响 | 第39页 |
| 3.6.1.7 不同转速对原生质体产量的影响 | 第39-41页 |
| 3.6.1.8 不同的渗透压稳定剂对原生质体的损耗率 | 第41页 |
| 3.6.1.9 原生质体大小及形成方式的观察 | 第41-42页 |
| 3.6.2 原生质体再生条件的测定 | 第42-44页 |
| 3.6.2.1 不同菌龄对原生质体再生的影响 | 第42页 |
| 3.6.2.2 酶反应时间对原生质体再生的影响 | 第42-43页 |
| 3.6.2.3 不同再生培养基对原生质体再生的影响 | 第43页 |
| 3.6.2.4 渗透压稳定剂种类和浓度对原生质体再生的影响 | 第43页 |
| 3.6.2.5 原生质体再生的观察 | 第43-44页 |
| 3.7 小结与讨论 | 第44-46页 |
| 4. GFP基因工程菌株的构建 | 第46-62页 |
| 4.1 供试材料 | 第46页 |
| 4.2 供试培养基 | 第46页 |
| 4.3 供试质粒 | 第46页 |
| 4.4 供试药剂及配置方法 | 第46-48页 |
| 4.4.1 主要试剂 | 第46-47页 |
| 4.4.2 酶 | 第47页 |
| 4.4.3 试剂盒 | 第47-48页 |
| 4.5 实验方法 | 第48-54页 |
| 4.5.1 质粒的提取 | 第48页 |
| 4.5.2 从琼脂糖凝胶中回收DNA | 第48-49页 |
| 4.5.3 重组质粒pHAMT35G-gfp-Hmb和pHsp-gfp-Hmb | 第49-52页 |
| 4.5.3.1 质粒HSP-gfp、pHAMT35G-gfp、pCT74和pCX62的提取 | 第49-50页 |
| 4.5.3.2 质粒的重组 | 第50页 |
| 4.5.3.3 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化 | 第50页 |
| 4.5.3.4 重组质粒的PCR快速鉴定 | 第50-51页 |
| 4.5.3.5 重组质粒的酶切鉴定 | 第51-52页 |
| 4.5.4 荔枝酸腐菌对潮霉素的敏感性测定 | 第52页 |
| 4.5.5 荔枝酸腐菌的转化 | 第52页 |
| 4.5.5.1 转化步骤 | 第52页 |
| 4.5.5.2 不同PEG对转化率的影响 | 第52页 |
| 4.5.5.3 不同质粒的转化率 | 第52页 |
| 4.5.6 转化子验证 | 第52-53页 |
| 4.5.6.1 转化子的形态特征及选择培养基上的再次筛选 | 第52-53页 |
| 4.5.6.2 荔枝酸腐菌转化子DNA的提取 | 第53页 |
| 4.5.6.3 转化子的PCR验证 | 第53页 |
| 4.5.7 转化子的荧光稳定性和菌丝生长速度 | 第53页 |
| 4.5.8 转化子致病性测定及侵染观察 | 第53-54页 |
| 4.6 结果与分析 | 第54-59页 |
| 4.6.1 重组质粒pHAMT35G-gfp-Hmb和pHsp-gfp-Hmb的构建 | 第54页 |
| 4.6.2 野生型菌株对潮霉素的敏感性 | 第54-55页 |
| 4.6.3 转化条件的筛选 | 第55-56页 |
| 4.6.3.1 不同质粒的转化率 | 第55-56页 |
| 4.6.3.2 不同PEG对转化率的影响 | 第56页 |
| 4.6.4 转化子的形态特征以及对潮霉素B的抗性水平 | 第56-57页 |
| 4.6.5 转化子的GFP基因验证 | 第57-58页 |
| 4.6.5.1 转化子的荧光观察 | 第57-58页 |
| 4.6.5.2 转化子的PCR鉴定 | 第58页 |
| 4.6.6 转化子的荧光稳定性与菌丝生长速度 | 第58-59页 |
| 4.6.7 转化子致病性测定及侵染观察 | 第59页 |
| 4.7 小结与讨论 | 第59-62页 |
| 5 结论与讨论 | 第62-63页 |
| 5.1 主要研究结果 | 第62页 |
| 5.2 特色 | 第62-63页 |
| 参考文献 | 第63-69页 |
| 致谢 | 第69页 |
