| 中文摘要 | 第1-13页 |
| 英文摘要 | 第13-16页 |
| 1 前言 | 第16-37页 |
| ·基因沉默 | 第16-17页 |
| ·沉默RNA | 第17-22页 |
| ·小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA） | 第17-18页 |
| ·微小RNA（microRNA，miRNA） | 第18-19页 |
| ·siRNA 和miRNA 的联系和区别 | 第19-21页 |
| ·其他参与沉默的小分子RNA | 第21-22页 |
| ·RNA 沉默的作用机制 | 第22-24页 |
| ·siRNA 途径 | 第23页 |
| ·miRNA 途径 | 第23-24页 |
| ·RNA 介导的病毒抗性 | 第24-28页 |
| ·RNA 介导的病毒抗性的特点 | 第26-27页 |
| ·RNA 介导的病毒抗性是转录后基因沉默的结果 | 第27-28页 |
| ·基于siRNA 的抗病毒策略 | 第28-29页 |
| ·植物抗病毒研究中高效的发夹RNA 植物表达载体的构建 | 第29-31页 |
| ·hpRNA 茎结构长度的影响 | 第29-30页 |
| ·hpRNA 环区域的影响 | 第30页 |
| ·核酸序列同源性的影响 | 第30-31页 |
| ·转录速度的影响 | 第31页 |
| ·基于miRNA 的抗病毒策略 | 第31-32页 |
| ·人工miRNA 技术的影响因素 | 第32-34页 |
| ·amiRNA 序列的设计与优化 | 第32-33页 |
| ·天然的miRNA 前体的选择 | 第33-34页 |
| ·马铃薯Y 病毒与抗病毒基因工程 | 第34-35页 |
| ·本研究的目的及其意义 | 第35-37页 |
| 2 材料与方法 | 第37-59页 |
| ·材料 | 第37页 |
| ·毒源 | 第37页 |
| ·供试植物 | 第37页 |
| ·菌株、质粒 | 第37页 |
| ·方法 | 第37-59页 |
| ·构建含发夹结构的转基因植物表达载体 | 第37-39页 |
| ·植物表达载体的构建策略 | 第37-38页 |
| ·PCR 扩增特异性引物设计 | 第38-39页 |
| ·构建amiRNA 转基因植物表达载体 | 第39-42页 |
| ·植物表达载体的构建策略 | 第40页 |
| ·amiRNA 的筛选 | 第40页 |
| ·引物的设计 | 第40-42页 |
| ·PCR 扩增目的片段 | 第42页 |
| ·目的片段与克隆载体的连接 | 第42页 |
| ·目的片段和质粒DNA 的酶切 | 第42-43页 |
| ·DNA 片段的回收（试剂盒法） | 第43页 |
| ·目的片段与质粒DNA 的连接 | 第43-44页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第44页 |
| ·质粒DNA 向大肠杆菌中转化（热激法） | 第44页 |
| ·转化菌落PCR 鉴定 | 第44-45页 |
| ·质粒DNA 的大量提取（碱性SDS 法） | 第45-47页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第47页 |
| ·重组质粒向农杆菌转化（冻融法） | 第47页 |
| ·农杆菌介导的瞬时侵染 | 第47-48页 |
| ·农杆菌介导的烟草转化 | 第48-49页 |
| ·植物总DNA 的提取（CTAB 法） | 第49页 |
| ·转基因植株的PCR 检测 | 第49页 |
| ·转基因植株的抗病性鉴定及ELISA 检测 | 第49-50页 |
| ·转基因植株的抗病性鉴定 | 第49-50页 |
| ·转基因植株的ELISA 检测 | 第50页 |
| ·Northern 杂交分析 | 第50-55页 |
| ·转基因植株总RNA 的提取（Trizol 一步提取法） | 第50-51页 |
| ·在含有甲醛的凝胶上进行RNA 电泳 | 第51页 |
| ·转膜 | 第51-52页 |
| ·探针制备 | 第52-53页 |
| ·DIG 标记有效性检测 | 第53-54页 |
| ·杂交 | 第54-55页 |
| ·转基因植株siRNA/miRNA 的提取及杂交分析 | 第55-59页 |
| ·转基因植株siRNA/miRNA 的提取 | 第55-56页 |
| ·siRNA/miRNA 电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳） | 第56-57页 |
| ·siRNA/miRNA 转膜（电转膜）及固定 | 第57-58页 |
| ·siRNA/miRNA 探针的制备 | 第58页 |
| ·siRNA/miRNA 杂交 | 第58-59页 |
| 3 结果与分析 | 第59-90页 |
| ·靶向于马铃薯Y 病毒CP 基因不同区段的hpRNA 介导的病毒抗性 | 第59-74页 |
| ·hpRNAi 植物表达载体的构建 | 第59-62页 |
| ·PVY CP 不同区段正向和反向目的片段的获得 | 第59-60页 |
| ·正向目的片段与表达载体pROKⅡ的连接 | 第60页 |
| ·反向目的片段与重组中间载体的连接 | 第60-62页 |
| ·农杆菌介导的瞬时侵染验证hpRNAi 植物表达载体的有效性 | 第62-65页 |
| ·转化农杆菌EHA105 菌株 | 第62-63页 |
| ·瞬时表达靶向PVY CP 的siRNA 的检测 | 第63-64页 |
| ·Northern 杂交检测瞬时侵染时靶RNA 的积累 | 第64-65页 |
| ·转基因烟草的获得 | 第65-66页 |
| ·转基因烟草的检测 | 第66-68页 |
| ·转基因烟草的抗病性分析 | 第68-71页 |
| ·转基因烟草的Northern 杂交分析 | 第71-73页 |
| ·转基因烟草植株中siRNA 的杂交分析 | 第73-74页 |
| ·T2代转基因植株的抗病性分析 | 第74页 |
| ·人工的miRNA 介导的马铃薯Y 病毒抗性 | 第74-90页 |
| ·amiRNA 的筛选及引物设计 | 第74-75页 |
| ·拟南芥天然miRNA 前体的克隆 | 第75-77页 |
| ·靶向于PVY CP 基因不同区段的人工miRNA 表达载体的构建 | 第77页 |
| ·重组表达载体的鉴定 | 第77-78页 |
| ·农杆菌介导的瞬时侵染检测amiRNA 表达载体的有效性 | 第78-80页 |
| ·转化农杆菌EHA105 菌株 | 第78-79页 |
| ·瞬时表达靶向PVY CP 的amiRNA 的检测 | 第79-80页 |
| ·Northern 杂交检测靶RNA 的积累 | 第80页 |
| ·转基因烟草的获得 | 第80-81页 |
| ·转基因烟草的检测 | 第81-83页 |
| ·转基因植株的抗病性分析 | 第83-86页 |
| ·转基因烟草的Northern 杂交分析 | 第86-87页 |
| ·转基因烟草植株中amiRNA 的杂交分析 | 第87-88页 |
| ·T2代转基因植株的抗病性分析 | 第88-90页 |
| 4 讨论 | 第90-98页 |
| 5 结论 | 第98-99页 |
| 参考文献 | 第99-115页 |
| 致谢 | 第115-116页 |
| 攻读学位期间发表论文情况 | 第116-117页 |
| 博士学位论文内容简介及自评 | 第117页 |
