| 摘要 | 第9-13页 |
| Abstract | 第13-16页 |
| 缩略词表 | 第17-18页 |
| 第一章 研究背景 | 第18-40页 |
| 1.1 链霉菌简介 | 第18-21页 |
| 1.1.1 链霉菌生长周期 | 第18-19页 |
| 1.1.2 链霉菌次级代谢产物 | 第19-21页 |
| 1.2 硫肽类抗生素 | 第21-27页 |
| 1.2.1 环噻唑霉素(cyclothiazomycin,CLT)的化学结构 | 第21-22页 |
| 1.2.2 硫肽类抗生素生物生物合成基因簇 | 第22-24页 |
| 1.2.3 环噻唑霉素生物合成基因簇 | 第24-27页 |
| 1.3 大环内酯类抗生素 | 第27-32页 |
| 1.3.1 FR-008的化学结构 | 第27-28页 |
| 1.3.2 多烯大环内酯类抗生素生物合成基因簇 | 第28-32页 |
| 1.3.2.1 匹马霉素(pimaricin)生物合成基因簇分析 | 第28-30页 |
| 1.3.2.2 FR-008/杀念菌素(candicidin)生物合成基因簇分析 | 第30-32页 |
| 1.4 链霉菌生物合成的调控机制 | 第32-38页 |
| 1.4.1 SARP家族调控蛋白(Streptomyces Antibiotic Regulatory Protein) | 第33-34页 |
| 1.4.2 LuxR家族调控蛋白 | 第34页 |
| 1.4.3 匹马霉素(pimaricin)生物合成基因簇中PimM/PimR的调控作用 | 第34-38页 |
| 1.4.3.1 PimM的功能研究 | 第35-37页 |
| 1.4.3.2 PimR的功能研究 | 第37-38页 |
| 1.5 立题依据与研究内容 | 第38-40页 |
| 第二章 吸水链霉菌5008环噻唑霉素生物合成的调控 | 第40-98页 |
| 2.1 实验材料 | 第41-50页 |
| 2.1.1 菌株及质粒 | 第41-42页 |
| 2.1.2 引物 | 第42-48页 |
| 2.1.3 培养基与试剂 | 第48-50页 |
| 2.3 实验方法 | 第50-61页 |
| 2.3.1 链霉菌的培养及菌种的保藏 | 第50页 |
| 2.3.2 链霉菌基因组提取 | 第50-51页 |
| 2.3.3 吸水链霉菌5008发酵产物生物活性测定 | 第51页 |
| 2.3.4 环噻唑霉素合成的HPLC检测 | 第51页 |
| 2.3.5 质谱检测 | 第51-52页 |
| 2.3.6 生物信息学分析网站以及软件 | 第52页 |
| 2.3.7 双交换缺失突变菌株的构建 | 第52-54页 |
| 2.3.7.1 用于双交换缺失突变的质粒构建 | 第52-53页 |
| 2.3.7.2 细菌与链霉菌属间接合转移 | 第53页 |
| 2.3.7.3 双交换缺失突变菌种的筛选 | 第53页 |
| 2.3.7.4 菌落PCR验证双交换菌株 | 第53-54页 |
| 2.3.8 Southern blot验证SHJG8833缺失突变菌株 | 第54页 |
| 2.3.9 SHJG8833缺失突变株的回补菌株的构建 | 第54-55页 |
| 2.3.10 吸水链霉菌5008 RNA的提取 | 第55页 |
| 2.3.11 RT-PCR以及Real-time PCR分析环噻唑霉素生物合成基因的表达 | 第55-56页 |
| (1) cDNA的合成 | 第55页 |
| (2) RT-PCR扩增 | 第55-56页 |
| (3) Real-time PCR反应 | 第56页 |
| 2.3.12 转录起始位点分析 | 第56-58页 |
| 2.3.12.1 5'RLM-RACE检测SHJG8833的转录起始位点 | 第56-57页 |
| 2.3.12.2 Primer Extension检测SHJG8833的转录起始位点 | 第57-58页 |
| 2.3.13 SHJG8833 DNA结合结构域与GST融合蛋白的表达与纯化 | 第58-59页 |
| 2.3.14 启动子序列的体外扩增 | 第59页 |
| 2.3.15 EMSA检测GST-SHJG8833~(DBD)与启动子片段的体外结合 | 第59-61页 |
| 2.4 实验结果 | 第61-95页 |
| 2.4.1 吸水链霉菌5008基因组中具有与吸水链霉菌10-22环噻唑霉素生物合成基因的同源基因 | 第61-62页 |
| 2.4.2 吸水链霉菌5008发酵物抑制玉米小斑菌的生长 | 第62-63页 |
| 2.4.3 吸水链霉菌5008发酵物的HPLC分析 | 第63-64页 |
| 2.4.4 吸水链霉菌5008发酵物的质谱分析 | 第64-65页 |
| 2.4.5 环噻唑霉素生物合成基因簇中调控基因的序列分析 | 第65-70页 |
| 2.4.5.1 SHJG8833序列分析 | 第65-68页 |
| 2.4.5.2 SHJG8837序列分析 | 第68-69页 |
| 2.4.5.3 SHJG8838序列分析 | 第69-70页 |
| 2.4.6 SHJG8833、SHJG8837和SHJG8838缺失突变菌株的构建 | 第70-73页 |
| 2.4.6.1 SHJG8833突变菌株A8833的构建 | 第70-71页 |
| 2.4.6.2 SHJG8837突变菌株A8837的构建 | 第71-72页 |
| 2.4.6.3 SHJG8838突变菌株A8838的构建 | 第72-73页 |
| 2.4.7 A8833、A8837和A8838突变菌株的环噻唑霉素产生情况 | 第73-77页 |
| 2.4.7.1 A8833环噻唑霉素的产生情况 | 第73-76页 |
| 2.4.7.2 A8837以及A8838的环噻唑霉素产生情况 | 第76-77页 |
| 2.4.8 SHJG8833转录起始位点的定位 | 第77-78页 |
| 2.4.9 A8833突变菌中环噻唑霉素生物合成基因的转录 | 第78-82页 |
| 2.4.9.1 环噻唑霉素生物合成基因表达的定性分析(RT-PCR) | 第78-81页 |
| 2.4.9.2 环噻唑霉素生物合成基因表达的定量分析(Real-time PCR) | 第81-82页 |
| 2.4.10 SHJG8826-SHJG8832的共转录分析 | 第82-84页 |
| 2.4.11 5008中部分生物合成基因转录起始位点(TSP)的定位 | 第84-86页 |
| 2.4.12 SHJG8833调控的基因是参与环噻唑霉素生物合成的关键基因 | 第86-90页 |
| 2.4.12.1 SHJG8824的敲除 | 第86-87页 |
| 2.4.12.2 SHJG8829的敲除 | 第87-88页 |
| 2.4.12.3 SHJG8831的敲除 | 第88页 |
| 2.4.12.4 SHJG8832的敲除 | 第88-89页 |
| 2.4.12.5 突变株△8824、△8829、△8831以及△8832的产素情况 | 第89-90页 |
| 2.4.13 SHJG8833 DNA结合结构域(DNA binding domain,DBD)的表达与纯化 | 第90-92页 |
| 2.4.14 SHJG8833~(DBD)与DNA的结合 | 第92-95页 |
| 2.4.14.1 SHJG8833~(DBD) P1具有DNA结合活性 | 第92-93页 |
| 2.4.14.2 SHJG8833~(DBD)与环噻唑霉素生物合成基因上游序列的结合 | 第93页 |
| 2.4.14.3 SHJG8833~(DBD)特异结合SHJG8828启动子序列 | 第93-94页 |
| 2.4.14.4 SHJG8833~(DBD)的保守结合序列分析 | 第94-95页 |
| 2.4.15 SHJG8833的调控机制 | 第95页 |
| 2.5 小结 | 第95-98页 |
| 第三章 FR-008生物合成的调控—FscRI的功能研究 | 第98-128页 |
| 3.1 实验材料 | 第99-103页 |
| 3.1.1 菌株及质粒 | 第99-100页 |
| 3.1.2 引物 | 第100-103页 |
| 3.2 实验方法 | 第103-106页 |
| 3.2.1 链霉菌基因组的提取 | 第103页 |
| 3.2.2 双交换缺失突变菌株的构建 | 第103页 |
| 3.2.2.1 双交换缺失突变菌种的筛选 | 第103页 |
| 3.2.3 fscRⅠ缺失突变菌株的回补菌株的构建 | 第103页 |
| 3.2.4 Southern blot验证fscRⅠ缺失突变株 | 第103-104页 |
| 3.2.5 链霉菌FR-008发酵产物的生物活性测定 | 第104页 |
| 3.2.6 HPLC检测链霉菌FR-008的合成情况 | 第104页 |
| 3.2.7 链霉菌FR-008 RNA的提取 | 第104页 |
| 3.2.8 RT-PCR以及Real-time PCR检测基因簇中基因转录情况 | 第104-105页 |
| 3.2.9 5'RLM-RACE定位fscRⅠ的转录起始位点 | 第105页 |
| 3.2.10 His-tagged FscRⅠ融合蛋白的表达与纯化 | 第105-106页 |
| 3.2.11 FscRⅠ DNA结合结构域与GST融合蛋白的表达与纯化 | 第106页 |
| 3.2.12 启动子序列的体外扩增 | 第106页 |
| 3.2.13 EMSA检测融合蛋白与启动子片段的体外结合 | 第106页 |
| 3.3 实验结果 | 第106-127页 |
| 3.3.1 FscRⅠ的序列分析 | 第107-109页 |
| 3.3.2 fscRⅠ的敲除 | 第109-110页 |
| 3.3.3 △fscRⅠ突变株的FR-008产生情况 | 第110-113页 |
| 3.3.4 fscRⅠ转录起始位点(TSP)的定位 | 第113-114页 |
| 3.3.5 △fscRⅠ突变菌中FR-008生物合成基因的转录 | 第114-117页 |
| 3.3.5.1 FR-008生物合成基因表达的定性分析(RT-PCR) | 第114-115页 |
| 3.3.5.2 FR-008生物合成基因表达的定量分析(Real-time PCR) | 第115-117页 |
| 3.3.6 FR-008生物合成基因的共转录分析 | 第117-118页 |
| 3.3.7 FscRⅠ的表达与纯化 | 第118-119页 |
| 3.3.8 FscRⅠ与启动子的相互作用 | 第119-122页 |
| 3.3.8.1 FscRⅠ与靶基因启动子的结合 | 第120-121页 |
| 3.3.8.2 FscRⅠ特异结合靶基因启动子 | 第121-122页 |
| 3.3.9 FscRⅠ~(DBD)与GST融合蛋白的表达与纯化 | 第122-123页 |
| 3.3.10 FscRⅠ~(DBD)与启动子序列的结合 | 第123-124页 |
| 3.3.11 FscRⅠ的保守结合序列分析 | 第124页 |
| 3.3.12 FscRⅠ保守结合序列的验证 | 第124-127页 |
| 3.4 小结 | 第127-128页 |
| 第四章 FR-008生物合成的调控-FscRⅣ的功能研究 | 第128-140页 |
| 4.1 实验材料 | 第128-129页 |
| 4.1.1 菌种以及质粒 | 第128-129页 |
| 4.1.2 引物 | 第129页 |
| 4.2 实验方法 | 第129-130页 |
| 4.2.1 双交换缺失突变株△fscRⅣ的构建 | 第129-130页 |
| 4.2.3 野生型FR-008、AfscRⅣ以及△fscRⅣCOM的产素水平检测 | 第130页 |
| 4.2.4 RT-PCR及Real-time PCR检测基因的转录情况 | 第130页 |
| 4.3 实验结果 | 第130-138页 |
| 4.3.1 FscRⅣ的序列分析 | 第130-132页 |
| 4.3.2 fscRⅣ的敲除 | 第132-133页 |
| 4.3.3 △fscRⅣ突变株的FR-008产生情况 | 第133-135页 |
| 4.3.4 △fscRⅣ突变菌中FR-008生物合成基因的转录 | 第135-138页 |
| 4.3.4.1 FR-008生物合成基因表达的定性分析(RT-PCR) | 第135-136页 |
| 4.3.4.2 FR-008生物合成基因表达的定量分析(Real-time PCR) | 第136-138页 |
| 4.4 小结 | 第138-140页 |
| 第五章 FR-008生物合成的调控-FscRⅡ/FscRⅢ的功能研究 | 第140-154页 |
| 5.1 实验材料 | 第140-142页 |
| 5.1.1 菌株及质粒 | 第140-141页 |
| 5.1.2 引物 | 第141-142页 |
| 5.2 实验方法 | 第142页 |
| 5.2.1 双交换缺失突变株△fscRⅡ、△fscRⅢ的构建 | 第142页 |
| 5.2.2 野生型FR-008、△fscRⅡ以及△fscRⅢ的产素水平检测 | 第142页 |
| 5.3 实验结果 | 第142-151页 |
| 5.3.1 fscRⅡ的功能研究 | 第142-147页 |
| 5.3.1.1 fscRⅡ序列分析 | 第142-144页 |
| 5.3.1.2 fscRⅡ的敲除 | 第144-145页 |
| 5.3.1.3 △fscRⅡ中FR-008产生情况 | 第145页 |
| 5.3.1.4 △fscRⅡ中FR-008生物合成基因的转录 | 第145-147页 |
| 5.3.2 fscRⅢ的功能研究 | 第147-151页 |
| 5.3.2.1 fscRⅢ序列分析 | 第147-148页 |
| 5.3.2.2 fscRⅢ的敲除 | 第148-149页 |
| 5.3.2.3 △fscRⅢ的FR-008产生情况 | 第149-150页 |
| 5.3.2.4 △fscRⅢ中FR-008生物合成基因的转录 | 第150-151页 |
| 5.5 小结 | 第151-154页 |
| 第六章 全文总结与展望 | 第154-160页 |
| 6.1 全文总结 | 第154-156页 |
| 6.1.1 SHJG8833的功能研究 | 第154-155页 |
| 6.1.2 FscRⅠ的功能研究 | 第155页 |
| 6.1.3 FscRⅡ/FscRⅢ的功能研究 | 第155页 |
| 6.1.4 FscRⅣ的功能研究 | 第155-156页 |
| 6.1.5 FscRⅠ、FscRⅢ、FscRⅢ以及FscRⅣ的作用机制分析 | 第156页 |
| 6.2 展望 | 第156-160页 |
| 6.2.1 环噻唑霉素生物合成的调控 | 第156-157页 |
| 6.2.2 FR-008生物合成的调控 | 第157-160页 |
| 参考文献 | 第160-170页 |
| 致谢 | 第170-172页 |
| 攻读博士学位期间发表及投稿中的研究论文目录 | 第172-173页 |
| 附件 | 第173-195页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第195页 |
