| 摘要 | 第3-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 第一章 综述 | 第10-27页 |
| 1.1 肝素和肝素前体 | 第10-11页 |
| 1.2 大肠杆菌发酵研究进展 | 第11-15页 |
| 1.2.1 大肠杆菌发酵研究概况 | 第11-12页 |
| 1.2.2 营养源 | 第12-13页 |
| 1.2.3 生长抑制物 | 第13-14页 |
| 1.2.4 培养条件 | 第14-15页 |
| 1.3 大肠杆菌补料方法 | 第15-17页 |
| 1.3.1 非反馈补料 | 第16页 |
| 1.3.2 反馈补料 | 第16-17页 |
| 1.4 Heparosan的提取和检测 | 第17-18页 |
| 1.4.1 Heparosan的分离提取 | 第17-18页 |
| 1.4.2 Heparosan的检测 | 第18页 |
| 1.5 基因工程技术在大肠杆菌发酵培养中对乙酸控制的应用 | 第18-20页 |
| 1.6 本课题的研究内容 | 第20-21页 |
| 参考文献 | 第21-27页 |
| 第二章 E.coli K5发酵产heparosan及其检测方法的优化 | 第27-52页 |
| 2.1 前言 | 第27-28页 |
| 2.2 实验材料 | 第28-32页 |
| 2.2.1 菌种 | 第28页 |
| 2.2.2 实验药品 | 第28-30页 |
| 2.2.3 培养基及主要试剂 | 第30页 |
| 2.2.4 实验仪器 | 第30-32页 |
| 2.3 实验方法 | 第32-37页 |
| 2.3.1 菌种培养 | 第32页 |
| 2.3.2 E.coli K5生物量的测定 | 第32-33页 |
| 2.3.3 Heparosan含量的测定 | 第33-34页 |
| 2.3.4 葡萄糖含量的测定 | 第34页 |
| 2.3.5 拟指数流加方法的建立 | 第34-35页 |
| 2.3.6 检测体系Ⅲ的建立 | 第35-36页 |
| 2.3.7 检测体系Ⅲ中酶量的确定 | 第36页 |
| 2.3.8 检测体系Ⅲ标准曲线的制作 | 第36页 |
| 2.3.9 应用检测体系Ⅲ与Ⅱ对样本heparosan含量的检测比较 | 第36-37页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第37-50页 |
| 2.4.1 培养基对E.coli K5发酵产heparosan的影响 | 第37-38页 |
| 2.4.2 氮源对E.coli K5发酵产heparosan的影响 | 第38-39页 |
| 2.4.3 KH_2PO_4对E. coli K5发酵产heparosan的影响 | 第39-40页 |
| 2.4.4 接种量对E.coli K5发酵产heparosan的影响 | 第40-41页 |
| 2.4.5 碳源对E.coli K5发酵产heparosan的影响 | 第41-42页 |
| 2.4.6 批次发酵 | 第42-43页 |
| 2.4.7 拟指数流加补料发酵(用氨水调pH) | 第43-45页 |
| 2.4.8 拟指数流加补料发酵(用NaOH调pH) | 第45-46页 |
| 2.4.9 葡萄糖反馈补料 | 第46-47页 |
| 2.4.10 检测体系Ⅲ中酶量的确定 | 第47-48页 |
| 2.4.11 检测体系Ⅲ标准曲线的制作 | 第48-49页 |
| 2.4.12 应用检测体系Ⅲ与Ⅱ对样本heparosan含量的检测比较 | 第49-50页 |
| 2.5 小结 | 第50-51页 |
| 参考文献 | 第51-52页 |
| 第三章 E.coli K5 rpoS基因缺失株的构建 | 第52-72页 |
| 3.1 前言 | 第52-53页 |
| 3.2 实验材料 | 第53-55页 |
| 3.2.1 菌株与质粒 | 第53页 |
| 3.2.2 试剂与工具酶 | 第53-54页 |
| 3.2.3 培养基及缓冲液 | 第54-55页 |
| 3.2.4 实验仪器 | 第55页 |
| 3.3 实验方法 | 第55-62页 |
| 3.3.1 E.coli K5基因组的提取 | 第55-56页 |
| 3.3.2 E.coli K5 rpoS的扩增 | 第56-57页 |
| 3.3.3 PCR产物的检测及切胶回收 | 第57-58页 |
| 3.3.4 送样测序 | 第58页 |
| 3.3.5 质粒pKD46,pKD4的提取 | 第58-59页 |
| 3.3.6 pKD46电转化E.coli K5 | 第59-60页 |
| 3.3.7 E.coli K5/pKD46的鉴定 | 第60页 |
| 3.3.8 线性打靶rpoS-kan-rpoS片段的制备 | 第60-61页 |
| 3.3.9 E.coli K5 /pKD46感受态细胞的制备 | 第61页 |
| 3.3.10 打靶DNA的热转化 | 第61页 |
| 3.3.11 重组菌株的鉴定 | 第61-62页 |
| 3.3.12 E.coli K5野生株和E. coli K5 rpoS突变株的生长状况 | 第62页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第62-69页 |
| 3.4.1 基因组的提取与目的基因的扩增 | 第62-63页 |
| 3.4.2 测序结果与序列分析 | 第63-64页 |
| 3.4.3 质粒pKD46,pKD4的提取 | 第64页 |
| 3.4.4 E.coli K5/pKD46菌株的获得 | 第64页 |
| 3.4.5 E.coli K5/pKD46的鉴定 | 第64-65页 |
| 3.4.6 打靶片段的制备 | 第65-66页 |
| 3.4.7 重组子的获得 | 第66页 |
| 3.4.8 转化子的验证 | 第66-69页 |
| 3.4.9 野生株和突变株的比较 | 第69页 |
| 3.5 小结 | 第69-70页 |
| 参考文献 | 第70-72页 |
| 第四章 结论与展望 | 第72-74页 |
| 4.1 结论 | 第72-73页 |
| 4.2 展望 | 第73-74页 |
| 致谢 | 第74-75页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文和专利 | 第75页 |
