| 摘要 | 第8-11页 |
| ABSTRACT | 第11-14页 |
| 第一部分 综述 | 第15-56页 |
| 第一章 干酪用牛凝乳酶替代品的研究进展 | 第15-32页 |
| 引言 | 第16-17页 |
| 1 凝乳酶的结构研究 | 第17-19页 |
| 1.1 凝乳酶的结构 | 第17页 |
| 1.2 凝乳酶原的活化 | 第17-18页 |
| 1.3 凝乳酶的进化 | 第18-19页 |
| 2 重组凝乳酶 | 第19-24页 |
| 2.1 重组牛凝乳酶的表达研究 | 第20-22页 |
| 2.1.1 原核表达 | 第20页 |
| 2.1.2 真核表达 | 第20-22页 |
| 2.1.3 转基因羊乳 | 第22页 |
| 2.2 其他动物重组凝乳酶的表达研究 | 第22-24页 |
| 2.2.1 重组绵羊凝乳酶 | 第22页 |
| 2.2.2 重组山羊凝乳酶 | 第22-23页 |
| 2.2.3 重组水牛凝乳酶 | 第23页 |
| 2.2.4 重组骆驼凝乳酶 | 第23-24页 |
| 3 植物和微生物凝乳酶 | 第24-25页 |
| 3.1 干酪促熟 | 第24-25页 |
| 3.2 降低苦味 | 第25页 |
| 3.3 酶的固定 | 第25页 |
| 4 展望 | 第25-26页 |
| 参考文献 | 第26-32页 |
| 第二章 骆驼凝乳酶的分子结构与制备干酪的研究进展 | 第32-56页 |
| 引言 | 第32-34页 |
| 1 骆驼凝乳酶的基因与结构 | 第34-38页 |
| 1.1 骆驼凝乳酶的基因 | 第34-35页 |
| 1.2 骆驼凝乳酶的结构 | 第35-38页 |
| 1.2.1 预测骆驼凝乳酶原的二级结构与三级结构 | 第35-37页 |
| 1.2.2 骆驼凝乳酶的晶体结构 | 第37-38页 |
| 2 骆驼凝乳酶的理化特性与酶学特性 | 第38-40页 |
| 2.1 骆驼凝乳酶的理化特性 | 第38-39页 |
| 2.2 骆驼凝乳酶的酶学特性 | 第39-40页 |
| 3 骆驼凝乳酶对主要乳蛋白水解的肽谱分析 | 第40-42页 |
| 3.1 骆驼凝乳酶对K-CN、AS1-CN和B-CN水解的肽谱分析 | 第40-42页 |
| 3.1.1 κ-CN水解肽谱 | 第40页 |
| 3.1.2 αs1-CN水解肽谱 | 第40-41页 |
| 3.1.3 β-CN水解肽谱 | 第41-42页 |
| 3.2 骆驼凝乳酶制备干酪苦味较低的原因分析 | 第42页 |
| 4 骆驼凝乳酶与K-CN底物特异结合的分子研究 | 第42-51页 |
| 4.1 结合位点的命名 | 第42-43页 |
| 4.2 骆驼凝乳酶与K-CN的亲合力 | 第43页 |
| 4.3 骆驼凝乳酶的表面静电荷 | 第43-45页 |
| 4.4 凝乳酶/κ-CN片段复合物模型 | 第45-47页 |
| 4.5 凝乳酶/K-CN复合物的结合自由能研究 | 第47-51页 |
| 5 骆驼凝乳制备干酪 | 第51-52页 |
| 6 展望 | 第52页 |
| 参考文献 | 第52-56页 |
| 第二部分 实验结果 | 第56-113页 |
| 第一章 原核表达重组牛凝乳酶原及重组牛凝乳酶酶学特性分析 | 第56-70页 |
| 引言 | 第57-58页 |
| 1 材料与方法 | 第58-61页 |
| 1.1 材料 | 第58-59页 |
| 1.1.1 菌种和质粒 | 第58-59页 |
| 1.1.2 试剂和培养基 | 第59页 |
| 1.2 方法 | 第59-61页 |
| 1.2.1 大肠杆菌表达载体的构建与鉴定 | 第59页 |
| 1.2.2 重组凝乳酶原基因诱导表达条件的优化 | 第59页 |
| 1.2.3 重组凝乳酶原大量表达与凝乳酶的初步纯化 | 第59-60页 |
| 1.2.4 重组凝乳酶活性测定 | 第60页 |
| 1.2.5 凝乳酶作用的最适温度的测定 | 第60页 |
| 1.2.6 凝乳酶的热稳定性 | 第60-61页 |
| 1.2.7 凝乳酶作用的最适pH值 | 第61页 |
| 1.2.8 凝乳酶的pH稳定性 | 第61页 |
| 1.2.9 金属离子对酶活的影响 | 第61页 |
| 1.2.10 蛋白酶抑制剂对酶活力的影响 | 第61页 |
| 2 结果 | 第61-67页 |
| 2.1 表达载体PET30A-PCHY的构建与重组牛凝乳酶原诱导表达条件的优化 | 第61-62页 |
| 2.2 重组菌株的诱导表达与初步纯化 | 第62-63页 |
| 2.3 重组牛凝乳酶原活化及凝乳活性检测 | 第63页 |
| 2.4 重组牛凝乳酶酶学特性分析 | 第63-67页 |
| 2.4.1 重组酶的最适作用温度 | 第63-64页 |
| 2.4.2 重组酶的最适作用pH | 第64页 |
| 2.4.3 重组酶的热稳定性 | 第64-65页 |
| 2.4.4 重组酶的pH稳定性 | 第65页 |
| 2.4.5 金属离子对酶活的影响 | 第65-66页 |
| 2.4.6 酶活性抑制实验 | 第66-67页 |
| 3 讨论 | 第67页 |
| 参考文献 | 第67-70页 |
| 第二章 重组牛凝乳酶的纯化与保存 | 第70-88页 |
| 引言 | 第70-72页 |
| 1 材料与方法 | 第72-73页 |
| 1.1 材料 | 第72页 |
| 1.1.1 菌种与质粒 | 第72页 |
| 1.1.2 试剂和培养基 | 第72页 |
| 1.2 方法 | 第72-73页 |
| 1.2.1 重组牛凝乳酶的表达与复性 | 第72页 |
| 1.2.2 重组牛凝乳酶原的活化 | 第72页 |
| 1.2.3 酶原活化浑浊液的离心纯化及SDS-PAGE检测 | 第72页 |
| 1.2.4 酶原活化浑浊液的自然沉降分离纯化及SDS-PAGE检测 | 第72-73页 |
| 1.2.5 饱和硫酸铵沉淀 | 第73页 |
| 1.2.6 酶活力的测定 | 第73页 |
| 1.2.7 蛋白定量 | 第73页 |
| 1.2.8 蛋白回收率和酶活提高倍数计算 | 第73页 |
| 1.2.9 添加辅料冻干实验 | 第73页 |
| 2 结果 | 第73-78页 |
| 2.1 经酸化/中和处理的重组牛凝乳酶原出现大量沉淀 | 第73-74页 |
| 2.2 SDS-PAGE检测离心上清与沉淀的组分 | 第74-75页 |
| 2.3 酶原酸化后回调不同PH值时上清与沉淀组分检测 | 第75页 |
| 2.4 饱和硫酸铵沉淀凝乳酶 | 第75-76页 |
| 2.5 重组凝乳酶的纯化步骤 | 第76页 |
| 2.6 重组凝乳酶的蛋白回收率与比活力提高情况 | 第76-77页 |
| 2.7 重组凝乳酶的冻干与复水 | 第77-78页 |
| 2.8 重组凝乳酶冻干辅料的添加 | 第78页 |
| 3 讨论 | 第78-83页 |
| 3.1 分析重组凝乳酶原活化过程中产生的沉淀原因 | 第79-81页 |
| 3.2 凝乳酶的总活力随着凝乳酶的纯化而增高 | 第81-83页 |
| 参考文献 | 第83-88页 |
| 第三章 单峰驼凝乳酶原的原核表达和活性检测 | 第88-99页 |
| 引言 | 第88-89页 |
| 1 材料与方法 | 第89-92页 |
| 1.1 材料 | 第89-90页 |
| 1.1.1 菌种和质粒 | 第89-90页 |
| 1.1.2 试剂和培养基 | 第90页 |
| 1.2 方法 | 第90-92页 |
| 1.2.1 大肠杆菌表达载体的构建与鉴定 | 第90页 |
| 1.2.2 重组凝乳酶原基因诱导表达条件的优化 | 第90页 |
| 1.2.3 重组凝乳酶原大量表达与检测 | 第90-91页 |
| 1.2.4 重组凝乳酶原在不同PH条件下的活化实验 | 第91页 |
| 1.2.5 添加不同NaCl终浓度对重组凝乳酶原自剪切效率的影响实验 | 第91页 |
| 1.2.6 重组凝乳酶原的活化与凝乳实验 | 第91-92页 |
| 2 结果 | 第92-95页 |
| 2.1 表达载体PET30A-PCHY-C的构建 | 第92页 |
| 2.2 重组蛋白诱导表达条件的优化 | 第92页 |
| 2.3 重组凝乳酶原大量表达及检测 | 第92-93页 |
| 2.4 不同PH条件下单峰驼凝乳酶原活化情况 | 第93-94页 |
| 2.5 添加NACL对单峰驼凝乳酶原自剪切效率的影响 | 第94页 |
| 2.6 重组凝乳酶的凝乳活性检测 | 第94-95页 |
| 3 讨论 | 第95-96页 |
| 参考文献 | 第96-99页 |
| 第四章 两种重组凝乳酶原活化速率的比较 | 第99-113页 |
| 引言 | 第100页 |
| 1 材料与方法 | 第100-101页 |
| 1.1 材料 | 第100-101页 |
| 1.1.1 菌种和质粒 | 第100-101页 |
| 1.1.2 试剂 | 第101页 |
| 1.2 方法 | 第101页 |
| 1.2.1 重组蛋白大量表达与包涵体复性 | 第101页 |
| 1.2.2 酶原活化(即酸化/中和处理) | 第101页 |
| 2 结果 | 第101-106页 |
| 2.1 重组单峰驼凝乳酶原与牛凝乳酶原在相同条件下活化速率比较 | 第101-104页 |
| 2.1.1 两种凝乳酶原酸化/中和处理2h | 第101页 |
| 2.1.2 牛凝乳酶原不同活化时间检测 | 第101-102页 |
| 2.1.3 单峰驼凝乳酶原活化时间检测 | 第102-103页 |
| 2.1.4 比较TE和PBS透析单峰驼凝乳酶原的活化速率 | 第103页 |
| 2.1.5 PBS和PB中的Na~+能够加速单峰驼凝乳酶原的活化 | 第103-104页 |
| 2.2 单峰驼凝乳酶原序列与牛凝乳酶原序列融合蛋白的表达与检测 | 第104-106页 |
| 2.2.1 融合蛋白表达载体的设计与构建 | 第104-105页 |
| 2.2.2 融合蛋白大量表达与活化情况的检测 | 第105-106页 |
| 3 讨论 | 第106-109页 |
| 参考文献 | 第109-113页 |
| 第三部分 结论与展望 | 第113-114页 |
| 附录1 英文缩略语 | 第114-115页 |
| 附录2 主要实验仪器 | 第115-116页 |
| 致谢 | 第116-117页 |
| 个人简介 | 第117页 |
| 参与科研项目情况 | 第117-118页 |
| 攻读博士学位期间发表和在审的学术论文 | 第118-119页 |
