| 摘要 | 第7-10页 |
| 英文摘要 | 第10-11页 |
| 前言 | 第12-32页 |
| (一) 基因治疗载体系统 | 第12-22页 |
| 1. 病毒载体系统应用 | 第12-18页 |
| 1.1 反转录病毒载体 | 第13-14页 |
| 1.2 慢病毒载体 | 第14-15页 |
| 1.3 腺相关病毒载体 | 第15-16页 |
| 1.4 腺病毒载体 | 第16-18页 |
| 2. 非病毒载体系统的应用 | 第18-21页 |
| 2.1 裸DNA的物理转移 | 第18-19页 |
| 2.2 通过化学载体分子的基因转移 | 第19-20页 |
| 2.3 具有特殊结构的治疗载体 | 第20-21页 |
| 3. 非病毒载体系统在基因转移中的优势 | 第21-22页 |
| (二) Β-地中海贫血基因治疗研究 | 第22-26页 |
| 1. 人类珠蛋白基因家族结构特点及其表达调控 | 第22-24页 |
| 2 β-地中海贫血的基因治疗策略 | 第24-26页 |
| 2.1 细胞水平基因转移研究 | 第24-25页 |
| 2.2 回体基因转移研究 | 第25-26页 |
| (三) 基于同源重组策略的基因治疗载体的研究 | 第26-32页 |
| 1. 同源重组机制 | 第27-29页 |
| 2 基于同源重组的新型人源染色体靶向的BAC载体 | 第29-32页 |
| 材料方法 | 第32-55页 |
| (一)、实验材料 | 第32-34页 |
| 1. 菌株和质粒 | 第32页 |
| 2. 细胞系 | 第32页 |
| 3. 限制性内切酶及修饰酶 | 第32页 |
| 4. 放射性核素 | 第32页 |
| 5. 本研究中使用的PCR引物 | 第32-33页 |
| 6. 其它主要试剂 | 第33页 |
| 7. 主要仪器 | 第33-34页 |
| (二) 实验方法 | 第34-55页 |
| 1. 研究的技术路线 | 第34-36页 |
| 1.1 新型人源染色体靶向BAC载体构建技术路线 | 第34-35页 |
| 1.2 人β-珠蛋白基因簇转移技术路线 | 第35-36页 |
| 2. 含人β-珠蛋白基因簇的重组靶向载体构建和鉴定 | 第36-41页 |
| 2.1 BAC质粒的制备 | 第36页 |
| 2.1.1 BAC质粒的小量制备 | 第36页 |
| 2.1.2 BAC质粒的大量制备 | 第36页 |
| 2.2 聚乙二醇(PEG)法纯化质粒DNA | 第36-37页 |
| 2.3 人β-珠蛋白基因簇DNA的回收 | 第37页 |
| 2.3.1 沟槽电泳法回收人β-珠蛋白基因簇大片段DNA | 第37页 |
| 2.3.2 低熔点琼脂糖凝胶回收人β-珠蛋白基因簇大片段DNA | 第37页 |
| 2.4 含人β-珠蛋白基因簇的靶向的BAC载体(BACMS/BGGC)亚克隆 | 第37-39页 |
| 2.4.1 载体去磷酸化 | 第37-38页 |
| 2.4.2 大片段DNA分子的连接 | 第38页 |
| 2.4.3 DH10B感受态细胞的制备和连接产物的转化 | 第38-39页 |
| 2.5 重组BAC靶向载体(BACMS/BGGC)的鉴定 | 第39-41页 |
| 2.5.1 斑点杂交 | 第39-40页 |
| 2.5.2 酶切鉴定 | 第40页 |
| 2.5.3 重组载体基因簇完整性鉴定分析 | 第40-41页 |
| 3. 细胞传代和培养 | 第41-42页 |
| 3.1 细胞复苏 | 第41页 |
| 3.2 细胞培养 | 第41-42页 |
| 3.3 细胞传代和冻存 | 第42页 |
| 3.4 G418和GCV溶液配制 | 第42页 |
| 4. 细胞转染和筛选 | 第42-44页 |
| 4.1 目的DNA的制备和纯化 | 第42-43页 |
| 4.2 脂质体转染细胞 | 第43页 |
| 4.3 电穿孔转染细胞 | 第43页 |
| 4.4 转染细胞的筛选和单克隆细胞株的获得 | 第43-44页 |
| 5. 单克隆细胞基因组DNA分析 | 第44-51页 |
| 5.1 基因组DNA PCR检测 | 第44-45页 |
| 5.1.1 基因组DNA提取 | 第44页 |
| 5.1.2 PCR扩增目的DNA策略 | 第44页 |
| 5.1.3 PCR扩增的条件 | 第44-45页 |
| 5.2 基因组DNA Southern blot整合位点分析 | 第45-46页 |
| 5.2.1 DNA探针模板制备 | 第45页 |
| 5.2.2 DNA探针标记 | 第45页 |
| 5.2.3 基因组DNA的酶切，电泳及转膜 | 第45-46页 |
| 5.2.4 杂交和自显影 | 第46页 |
| 5..3 转移DNA完整性分析 | 第46页 |
| 5.3.1 探针模板制备和探针标记 | 第46页 |
| 5.3.2 基因组DNA酶切电泳 | 第46页 |
| 5.3.3 转膜、杂交和自显影 | 第46页 |
| 5.4 单克隆细胞染色体荧光原位杂交分析(DNA FISH) | 第46-51页 |
| 5.4.1 常规收集细胞染色体和滴片 | 第46-47页 |
| 5.4.2 常规G显带 | 第47-48页 |
| 5.4.3 高分辩率方法处理和收集细胞染色体 | 第48-49页 |
| 5.4.4 探针直接标记 | 第49-50页 |
| 5.4.5 常规染色体荧光原位杂交(DNA FISH) | 第50-51页 |
| 5.4.6 染色体G-显带荧光原位杂交(DNA G-banding-FISH) | 第51页 |
| 6. 目的基因—人γ~A-珠蛋白基因表达水平分析 | 第51-55页 |
| 6.1 Hemin诱导K562细胞分化 | 第51-52页 |
| 6.2 联苯胺染色试剂配制 | 第52页 |
| 6.3 提取细胞总RNA | 第52页 |
| 6.4 RNase保护实验 | 第52-55页 |
| 6.4.1 RNA探针标记 | 第52-53页 |
| 6.4.2 RNA探针纯化 | 第53-54页 |
| 6.4.3 RNA: RNA杂交及RNase反应 | 第54页 |
| 6.4.4 变性胶电泳及放射自显影 | 第54-55页 |
| 结果 | 第55-71页 |
| (一) 含人β-珠蛋白基因簇靶向载体构建和鉴定 | 第55-58页 |
| 1. 斑点杂交 | 第55页 |
| 2. 酶切鉴定 | 第55-57页 |
| 2.1 NotI酶切鉴定BACMS/BGGC | 第55-56页 |
| 2.2 不同酶切鉴定BACMS/BGGC | 第56-57页 |
| 3. Southern blot鉴定人β-珠蛋白基因簇完整性 | 第57-58页 |
| (二) 单克隆细胞株的获得 | 第58页 |
| (三) 单克隆细胞基因组DNA结构分析 | 第58-70页 |
| 1. PCR检测 | 第58-60页 |
| 2. Southern blot分析 | 第60-63页 |
| 2.1 整合位点分析 | 第60-62页 |
| 2.2 转移DNA完整性分析 | 第62-63页 |
| 3. DNA FISH分析 | 第63-70页 |
| 3.1 K562细胞系核型分析 | 第63-66页 |
| 3.2 常规DNA-FISH分析 | 第66-67页 |
| 3.3 G-带DNA-FISH分析 | 第67-70页 |
| (三) 人Γ~A-珠蛋白基因表达水平分析 | 第70-71页 |
| 讨论 | 第71-84页 |
| (一) 新型人源染色体靶向载体介导的Β-地中海贫血基因治疗 | 第71-74页 |
| 1. 新型靶向载体介导人β-珠蛋白基因簇的转移 | 第71-72页 |
| 2. 新型人源染色体靶向载体介导基因转移的优势 | 第72-73页 |
| 3. 靶细胞的选择 | 第73-74页 |
| (二) 成簇基因转移与基因治疗 | 第74-75页 |
| (三) 基于同源重组策略的非病毒载体介导基因转移 | 第75-77页 |
| (四) 同源重组过程中的定点整合与随机整合 | 第77-81页 |
| (五) 本研究的不足之处 | 第81-83页 |
| (六) 展望 | 第83-84页 |
| 小结 | 第84-85页 |
| 参考文献 | 第85-91页 |
| 文献综述 | 第91-106页 |
| 缩略语 | 第106-108页 |
| 致谢 | 第108-109页 |
| 个人简历 | 第109页 |
