| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 第一章 前言 | 第13-24页 |
| 1.1 链霉菌和抗生素 | 第13-15页 |
| 1.1.1 链霉菌 | 第13-14页 |
| 1.1.2 抗生素介绍 | 第14-15页 |
| 1.2 苯并异色烷醌家族化合物 | 第15-20页 |
| 1.2.1 苯并异色烷醌家族化合物简介 | 第15-16页 |
| 1.2.2 苯并异色烷醌家族抗生素生物合成 | 第16-20页 |
| 1.3 美达霉素和Med-ORF12 | 第20-21页 |
| 1.3.1 链霉菌Streptomyces sp.AM7161 | 第20页 |
| 1.3.2 美达霉素生物合成 | 第20-21页 |
| 1.4 酮基还原酶: RED1和RED2 | 第21-22页 |
| 1.5 本研究的意义及目的 | 第22-24页 |
| 第二章 材料与方法 | 第24-38页 |
| 2.1 菌株质粒及引物 | 第24-26页 |
| 2.2 培养基 | 第26-29页 |
| 2.2.1 链霉菌培养基 | 第26-29页 |
| 2.2.2 大肠杆菌培养基 | 第29页 |
| 2.2.3 HPLC和LC/MS分析条件 | 第29页 |
| 2.3 溶液和试剂 | 第29-32页 |
| 2.3.1 大肠杆菌质粒DNA小量提取试剂[Sambrook J et al.,1996]参考《分子克隆手册》配制 | 第29页 |
| 2.3.2 抗生素 | 第29-30页 |
| 2.3.3 链霉菌原生质体制备和转化试剂 | 第30-32页 |
| 2.4 实验方法 | 第32-38页 |
| 2.4.1 大肠杆菌质粒DNA小量提取(碱性裂解法) | 第32页 |
| 2.4.2 大肠杆菌感受态制备及转化 | 第32-33页 |
| 2.4.3 DNA体外操作 | 第33-34页 |
| 2.4.4 大肠杆菌菌种的保存 | 第34页 |
| 2.4.5 链霉菌的液体和固体培养 | 第34页 |
| 2.4.6 链霉菌孢子的收集 | 第34-35页 |
| 2.4.7 链霉菌基因组DNA的提取 | 第35页 |
| 2.4.8 链霉菌的发酵培养和产物粗提取 | 第35页 |
| 2.4.9 链霉菌原生质体的制备和转化 | 第35-36页 |
| 2.4.10 接合转移实验 | 第36-37页 |
| 2.4.11 生物信息学分析 | 第37-38页 |
| 第三章 med-ORF12的生物信息学分析 | 第38-43页 |
| 3.1 Med-ORF12进化树构建 | 第38-39页 |
| 3.2 Med-ORF12及其同源序列的多序列比对分析 | 第39-41页 |
| 3.3 讨论 | 第41-43页 |
| 第四章 med-ORF12的敲除 | 第43-54页 |
| 4.1 基因敲除质粒的构建 | 第43-49页 |
| 4.1.1 med-ORF12 L臂和R臂的克隆载体的构建 | 第44-46页 |
| 4.1.2 L臂和R臂的连接 | 第46-47页 |
| 4.1.3 构建含L臂和R臂的pYH7重组质粒 | 第47-48页 |
| 4.1.4 构建接合转移的菌株ET12567(pUZ8002)/pHSL124 | 第48-49页 |
| 4.2 野生型链霉菌中med-ORF12的敲除 | 第49-51页 |
| 4.2.1 ET12567/pUZ8002/pHSL124与野生型链霉菌的接合转移 | 第49页 |
| 4.2.2 基因敲除转化子的筛选及验证 | 第49-51页 |
| 4.3 med-ORF12缺失对于野生菌产素影响 | 第51-52页 |
| 4.4 讨论 | 第52-54页 |
| 第五章 突变菌株的中间产物分析 | 第54-61页 |
| 5.1 CH999/pRM5宿主表达系统介绍 | 第54-56页 |
| 5.1.1 pRM5导入CH999,构建CH999/pRM5 | 第55-56页 |
| 5.2 发酵产物初提及HPLC分析 | 第56页 |
| 5.3 LC/MS质谱分析 | 第56-59页 |
| 5.4 Med-ORF12参与生物合成反应路线图推测 | 第59页 |
| 5.5 讨论 | 第59-61页 |
| 第六章 med-ORF12的回补和超表达 | 第61-66页 |
| 6.1 缺失菌HQ的回补 | 第61-62页 |
| 6.2 发酵液产素分析及HPLC分析 | 第62页 |
| 6.3 med-ORF12的超表达 | 第62-63页 |
| 6.4 超量表达med-ORF12对美达霉素产量的影响 | 第63-64页 |
| 6.5 讨论 | 第64-66页 |
| 总结与展望 | 第66-68页 |
| 参考文献 | 第68-74页 |
| 硕士期间发表的论文 | 第74-75页 |
| 致谢 | 第75页 |
