| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 英文缩略词表 | 第9-15页 |
| 第一章 绪论 | 第15-31页 |
| 1.1 CRISPR-Cas9技术的发生与发展 | 第15-25页 |
| 1.1.1 人工核酸内切酶简介 | 第15-16页 |
| 1.1.2 CRISPR-Cas9的发现 | 第16页 |
| 1.1.3 CRISPR-Cas9的结构及作用机理 | 第16-18页 |
| 1.1.4 CRISPR-Cas9系统的应用 | 第18-21页 |
| 1.1.5 CRISPR-Cas9系统的脱靶效应及提高特异性的策略 | 第21-24页 |
| 1.1.6 CRISPR-Cas9技术在肿瘤研究中的意义 | 第24-25页 |
| 1.2 BSP在乳腺癌骨转移中的研究进展 | 第25-29页 |
| 1.2.1 BSP的结构与功能 | 第25-27页 |
| 1.2.2 BSP与乳腺癌转移 | 第27-28页 |
| 1.2.3 调控BSP表达对乳腺癌细胞骨转移生物学性质的影响 | 第28-29页 |
| 1.3 本课题研究意义及技术路线 | 第29-31页 |
| 1.3.1 研究意义 | 第29-30页 |
| 1.3.2 本课题的技术路线 | 第30-31页 |
| 第二章 表达Cas9蛋白乳腺癌细胞株的构建及筛选 | 第31-46页 |
| 2.1 引言 | 第31页 |
| 2.2 实验材料 | 第31-34页 |
| 2.2.1 细胞和质粒 | 第31页 |
| 2.2.2 主要试剂 | 第31-32页 |
| 2.2.3 主要溶液 | 第32-33页 |
| 2.2.4 主要仪器设备 | 第33-34页 |
| 2.3 实验方法 | 第34-42页 |
| 2.3.1 细胞培养 | 第34-35页 |
| 2.3.2 质粒转化和提取 | 第35-37页 |
| 2.3.3 Cas9慢病毒颗粒的制备与转染 | 第37-39页 |
| 2.3.4 流式细胞术检测绿色荧光细胞 | 第39页 |
| 2.3.5 Western Blot检测Cas9蛋白的表达 | 第39-41页 |
| 2.3.6 免疫细胞化学检测Cas9蛋白的表达 | 第41页 |
| 2.3.7 统计分析 | 第41-42页 |
| 2.4 结果和讨论 | 第42-44页 |
| 2.4.1 G418对231BO细胞的杀伤曲线 | 第42页 |
| 2.4.2 表达Cas9蛋白的231BO-Cas9细胞的筛选 | 第42-43页 |
| 2.4.3 Western blot检测Cas9蛋白的表达 | 第43-44页 |
| 2.4.4 免疫细胞化学检测Cas9蛋白的表达 | 第44页 |
| 2.5 本章小结 | 第44-46页 |
| 第三章 Cas9蛋白对亲骨转移人乳腺癌细胞株生物学性质和超微结构的影响 | 第46-53页 |
| 3.1 引言 | 第46页 |
| 3.2 实验材料 | 第46-47页 |
| 3.2.1 细胞和质粒 | 第46页 |
| 3.2.2 主要试剂 | 第46页 |
| 3.2.3 主要溶液 | 第46-47页 |
| 3.2.4 主要仪器设备 | 第47页 |
| 3.3 实验方法 | 第47-50页 |
| 3.3.1 细胞培养 | 第47-48页 |
| 3.3.2 实时无标记动态细胞分析技术检测细胞的增殖 | 第48页 |
| 3.3.3 细胞划痕实验 | 第48-49页 |
| 3.3.4 透射电镜观察细胞超微结构 | 第49-50页 |
| 3.3.5 统计分析 | 第50页 |
| 3.4 结果和讨论 | 第50-52页 |
| 3.4.1 Cas9蛋白对231BO细胞增殖的影响 | 第50页 |
| 3.4.2 Cas9蛋白对231BO细胞迁移性质的影响 | 第50-51页 |
| 3.4.3 231BO细胞超微结构的变化 | 第51-52页 |
| 3.5 本章小结 | 第52-53页 |
| 第四章 CRISPR-Cas9技术介导BSP基因编辑对乳腺癌细胞生物学性质的影响 | 第53-82页 |
| 4.1 引言 | 第53页 |
| 4.2 实验材料 | 第53-57页 |
| 4.2.1 细胞和质粒 | 第53-54页 |
| 4.2.2 主要试剂 | 第54-55页 |
| 4.2.3 主要溶液 | 第55-56页 |
| 4.2.4 主要仪器设备 | 第56-57页 |
| 4.3 实验方法 | 第57-69页 |
| 4.3.1 gRNA的设计 | 第57-58页 |
| 4.3.2 质粒转化 | 第58页 |
| 4.3.3 无内毒素质粒提取 | 第58-59页 |
| 4.3.4 质粒DNA浓度的测定 | 第59页 |
| 4.3.5 gRNA序列与质粒的连接 | 第59-60页 |
| 4.3.6 琼脂糖凝胶电泳验证质粒DNA大小及完整性 | 第60页 |
| 4.3.7 基因测序验证gRNA与质粒的连接 | 第60页 |
| 4.3.8 gRNA慢病毒颗粒的制备与转染 | 第60-62页 |
| 4.3.9 流式细胞术检测荧光细胞 | 第62页 |
| 4.3.10 SURVEYOR检测基因的突变 | 第62-65页 |
| 4.3.11 测序验证基因突变 | 第65页 |
| 4.3.12 Western Blot检测BSP蛋白的表达 | 第65-67页 |
| 4.3.13 CCK-8法检测细胞的增殖 | 第67-68页 |
| 4.3.14 细胞划痕实验 | 第68页 |
| 4.3.15 平板细胞克隆形成实验 | 第68-69页 |
| 4.3.16 统计分析 | 第69页 |
| 4.4 结果和讨论 | 第69-80页 |
| 4.4.1 基因测序验证gRNA序列与慢病毒载体连接 | 第69-70页 |
| 4.4.2 嘌呤霉素对231BO和231BO-Cas9细胞的杀伤曲线 | 第70-71页 |
| 4.4.3 gRNA慢病毒转染细胞的筛选 | 第71-72页 |
| 4.4.4 最佳退火温度的鉴定 | 第72-73页 |
| 4.4.5 T7EⅠ酶切鉴定 | 第73页 |
| 4.4.6 基因测序检测基因突变 | 第73-76页 |
| 4.4.7 Western blot检测BSP蛋白的表达 | 第76-77页 |
| 4.4.8 CCK-8检测细胞增殖 | 第77-78页 |
| 4.4.9 划痕实验检测细胞迁移能力 | 第78-79页 |
| 4.4.10 平板细胞克隆形成实验 | 第79-80页 |
| 4.5 本章小结 | 第80-82页 |
| 结论与展望 | 第82-84页 |
| 一、结论 | 第82-83页 |
| 二、不足与展望 | 第83页 |
| 三、本论文的创新之处 | 第83-84页 |
| 参考文献 | 第84-92页 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 | 第92-93页 |
| 致谢 | 第93-94页 |
| 附件 | 第94页 |
