重组亚油酸异构酶在乳酸克鲁维酵母中表达条件的优化及微囊化
| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4页 |
| 1 前言 | 第11-20页 |
| 1.1 共轭亚油酸 | 第11页 |
| 1.2 CLA的天然来源 | 第11页 |
| 1.3 CLA的生成 | 第11-13页 |
| 1.3.1 内源合成CLA | 第11-12页 |
| 1.3.2 化学异构法生成CLA | 第12页 |
| 1.3.3 微生物发酵法生成CLA | 第12-13页 |
| 1.4 植物乳杆菌P-8 | 第13页 |
| 1.5 基因工程菌 | 第13-15页 |
| 1.5.1 原核系统表达亚油酸异构酶 | 第14页 |
| 1.5.2 真核系统表达亚油酸异构酶 | 第14页 |
| 1.5.3 真核系统表达优势 | 第14-15页 |
| 1.5.4 乳酸克鲁维酵母 | 第15页 |
| 1.6 亚油酸异构酶酶学性质的研究 | 第15-16页 |
| 1.6.1 酶的催化专一性 | 第15-16页 |
| 1.6.2 热对酶活性及稳定性的影响 | 第16页 |
| 1.6.3 pH对酶活性及稳定性的影响 | 第16页 |
| 1.7 酶的稳定性改善 | 第16-17页 |
| 1.8 研究目的、意义和研究内容 | 第17-19页 |
| 1.8.1 研究目的、意义 | 第17-18页 |
| 1.8.2 研究内容 | 第18-19页 |
| 1.9 技术路线 | 第19-20页 |
| 2 试验材料与方法 | 第20-37页 |
| 2.1 试验材料 | 第20-24页 |
| 2.1.1 菌和质粒 | 第20-21页 |
| 2.1.2 培养基 | 第21页 |
| 2.1.3 酶和试剂 | 第21-23页 |
| 2.1.4 引物 | 第23页 |
| 2.1.5 仪器 | 第23-24页 |
| 2.2 试验方法 | 第24-36页 |
| 2.2.1 克隆载体的构建 | 第24-28页 |
| 2.2.2 表达载体的构建 | 第28页 |
| 2.2.3 酵母细胞的转化 | 第28-30页 |
| 2.2.4 表达条件的优化 | 第30-32页 |
| 2.2.5 发酵上清液的纯化 | 第32-33页 |
| 2.2.6 重组亚油酸异构酶酶含量的测定 | 第33-34页 |
| 2.2.7 重组亚油酸异构酶酶活力测定 | 第34-35页 |
| 2.2.8 SDS-PAGE检测 | 第35页 |
| 2.2.9 微囊化 | 第35-36页 |
| 2.3 数据处理 | 第36-37页 |
| 3 结果与分析 | 第37-54页 |
| 3.1 构建克隆载体 | 第37-39页 |
| 3.1.1 植物乳杆菌P-8基因组DNA的提取 | 第37页 |
| 3.1.2 亚油酸异构酶基因的PCR | 第37-38页 |
| 3.1.3 阳性鉴定 | 第38页 |
| 3.1.4 双酶切 | 第38-39页 |
| 3.2 鉴定转化 | 第39-40页 |
| 3.2.1 菌落PCR鉴定 | 第39页 |
| 3.2.2 双酶切鉴定 | 第39-40页 |
| 3.2.3 测序鉴定 | 第40页 |
| 3.3 酵母的生长曲线 | 第40页 |
| 3.4 蛋白标准曲线 | 第40-41页 |
| 3.5 CLA标准曲线绘制 | 第41-42页 |
| 3.6 表达条件的优化 | 第42-47页 |
| 3.6.1 时间对酶活的影响 | 第42页 |
| 3.6.2 温度对酶活的影响 | 第42-43页 |
| 3.6.3 培养基pH对酶活的影响 | 第43页 |
| 3.6.4 培养基的不同碳源对酶活的影响 | 第43-44页 |
| 3.6.5 接种量对酶活力的影响 | 第44页 |
| 3.6.6 装瓶量对酶活力的影响 | 第44-45页 |
| 3.6.7 摇床转速对酶活力的影响 | 第45页 |
| 3.6.8 正交试验结果 | 第45-47页 |
| 3.6.9 最佳条件表达 | 第47页 |
| 3.7 发酵液的SDS-PAGE检测 | 第47-48页 |
| 3.8 发酵液的浓缩与纯化 | 第48-50页 |
| 3.8.1 梯度浓缩 | 第48页 |
| 3.8.2 层析纯化结果 | 第48-49页 |
| 3.8.3 纯化后的SDS-PAGE | 第49页 |
| 3.8.4 纯化前后酶活力的测定 | 第49-50页 |
| 3.9 微囊化 | 第50-54页 |
| 3.9.1 海藻酸钠微囊化 | 第50页 |
| 3.9.2 聚电解质微囊化 | 第50-51页 |
| 3.9.3 两种方法比较 | 第51-54页 |
| 4 讨论 | 第54-55页 |
| 5 结论 | 第55页 |
| 6 创新点 | 第55-56页 |
| 致谢 | 第56-57页 |
| 参考文献 | 第57-62页 |
| 作者简介 | 第62页 |
