| 摘要 | 第1-8页 |
| ABSTRACT | 第8-12页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-22页 |
| 前言 | 第12页 |
| ·VEGF164基因的研究进展 | 第12-13页 |
| ·KAP6.1 皮肤组织特异性启动子的研究进展 | 第13-15页 |
| ·基因打靶与基因敲入的研究进展 | 第15-21页 |
| ·基因打靶与转基因技术 | 第15-17页 |
| ·基因打靶的原理 | 第17-18页 |
| ·影响基因打靶效率的因素 | 第18页 |
| ·CRISPR/Cas9核酸内切酶系统的靶向切割作用 | 第18-20页 |
| ·利用CRISPR/Cas9系统的基因敲入 | 第20-21页 |
| ·研究目的与意义 | 第21-22页 |
| 第二章 VEGF164基因靶向KAP6.13’ UTR的同源打靶载体构建 | 第22-44页 |
| ·材料与方法 | 第23-35页 |
| ·材料 | 第23页 |
| ·方法 | 第23-35页 |
| ·结果与分析 | 第35-42页 |
| ·PB-G载体元件克隆 | 第35页 |
| ·PB-G构建与鉴定 | 第35-36页 |
| ·T2A 连入 PB-G | 第36-37页 |
| ·KAP6.1 同源臂区域扩增 | 第37-38页 |
| ·同源臂连入T载体 | 第38页 |
| ·KAP-H1与KAP-H2连入PB-G-T2A | 第38-40页 |
| ·DsRed连入PB-G-H | 第40页 |
| ·VEGF164连入PB-G-H-DsRed | 第40-41页 |
| ·PB-G-H-VEGF164-DsRed鉴定 | 第41-42页 |
| ·讨论 | 第42-43页 |
| ·小结 | 第43-44页 |
| 第三章 CRISPR/CAS9靶向切割KAP6.13’ UTR的效果研究 | 第44-59页 |
| ·材料与方法 | 第44-49页 |
| ·材料 | 第44页 |
| ·方法 | 第44-49页 |
| ·结果与分析 | 第49-57页 |
| ·sgRNA靶位点与脱靶位点的确定 | 第49页 |
| ·sgRNA载体构建与鉴定 | 第49-50页 |
| ·绒山羊胎儿成纤维细胞稻瘟菌素筛选浓度确定 | 第50页 |
| ·sgRNA与Cas9载体共转胎儿成纤维细胞 | 第50-51页 |
| ·T7E1酶切检测切割效率 | 第51页 |
| ·不同sgRNA造成突变类型 | 第51-53页 |
| ·Off-target检测结果 | 第53-57页 |
| ·讨论 | 第57-58页 |
| ·小结 | 第58-59页 |
| 第四章 CRISPR/CAS9系统介导VEGF164定点敲入细胞的构建 | 第59-72页 |
| ·材料与方法 | 第59-63页 |
| ·材料 | 第59页 |
| ·方法 | 第59-63页 |
| ·结果与分析 | 第63-70页 |
| ·sgRNA-3、sgRNA-4、sgRNA-5、sgRNA12：Cas9介导的外源基因敲入效率分析 | 第63-65页 |
| ·阳性细胞克隆筛选 | 第65页 |
| ·细胞克隆敲入情况鉴定 | 第65-69页 |
| ·外源基因表达情况检测以及对KAP6.1 表达的影响 | 第69-70页 |
| ·讨论 | 第70-71页 |
| ·小结 | 第71-72页 |
| 第五章 结论 | 第72-74页 |
| ·研究结论 | 第72页 |
| ·创新点 | 第72-73页 |
| ·下一步研究内容 | 第73-74页 |
| 参考文献 | 第74-81页 |
| 附录 | 第81-94页 |
| 致谢 | 第94-95页 |
| 作者简介 | 第95页 |
