| 致谢 | 第1-9页 |
| 摘要 | 第9-10页 |
| 第一章 绪论 | 第10-21页 |
| ·烟草普通花叶病毒 | 第10-11页 |
| ·烟草普通花叶病毒的发现 | 第10页 |
| ·烟草普通花叶病毒的分子学特征 | 第10页 |
| ·烟草普通花叶病毒的生物学特征 | 第10-11页 |
| ·传统手段防治烟草花叶病 | 第11-13页 |
| ·烟草抗花叶病品种的选育 | 第11-12页 |
| ·农业防治 | 第12页 |
| ·化学防治 | 第12-13页 |
| ·生物防治 | 第13页 |
| ·天然抗病毒物质防治 | 第13页 |
| ·基因工程技术防治烟草花叶病 | 第13-14页 |
| ·病毒外壳蛋白基因介导的抗性（CPMR） | 第13页 |
| ·病毒复制酶基因介导的抗性 | 第13-14页 |
| ·病毒卫星RNA 的利用 | 第14页 |
| ·反义RNA 介导的抗病毒特性 | 第14页 |
| ·RNAi 技术防治烟草花叶病 | 第14-21页 |
| ·RNAi 的发现 | 第14-15页 |
| ·RNAi 的机制 | 第15-16页 |
| ·RNAi 的特征 | 第16-17页 |
| ·利用RNAi 技术的策略 | 第17-21页 |
| ·化学合成法 | 第17页 |
| ·体外转录法 | 第17页 |
| ·传统的以酶切、酶连为基础的RNA 干扰载体构建方法 | 第17-18页 |
| ·以同源重组为基础的植物RNA 干扰表达载体构建方法 | 第18-19页 |
| ·以重组PCR 技术为基础结合酶切、酶连的RNA 干扰载体构建方法 | 第19-21页 |
| 第二章 构建表达hpRNA 的工程菌DY-hp | 第21-47页 |
| ·材料 | 第21-22页 |
| ·试剂耗材 | 第21页 |
| ·仪器 | 第21-22页 |
| ·实验内容 | 第22-33页 |
| ·TMV 外壳蛋白基因的获得 | 第22-26页 |
| ·烟叶总RNA 的提取 | 第22-23页 |
| ·引物设计 | 第23页 |
| ·反转录、PCR | 第23-25页 |
| ·添加酶连体系 | 第25页 |
| ·酶连产物转化感受态细胞（DH5α） | 第25-26页 |
| ·挑取转化子于液体LB 培养后提取质粒、电泳检测并测序 | 第26页 |
| ·构建克隆载体pMD19-EH | 第26-30页 |
| ·引物设计 | 第26-27页 |
| ·扩增EK326、HK429 片段 | 第27页 |
| ·KpnⅠ分别单酶切EK326、HK429 | 第27-28页 |
| ·回收EK326（-）、HK429（-） | 第28页 |
| ·添加EK326（-）、HK429（-）、pMD19-T simple 共同酶连体系 | 第28-29页 |
| ·酶连产物转化感受态细胞（DH5α） | 第29页 |
| ·挑取转化子于液体LB 培养后提取质粒、电泳检测并测序 | 第29页 |
| ·酶切验证pMD19-EH | 第29-30页 |
| ·构建表达载体pET21-EH | 第30-31页 |
| ·回收EH（--） | 第30页 |
| ·回收pET21（--） | 第30页 |
| ·添加EH（--）、pET21（--）酶连体系 | 第30页 |
| ·酶连产物转化感受态细胞（DH5α） | 第30页 |
| ·挑取转化子于液体LB 培养后提取质粒、电泳检测 | 第30页 |
| ·酶切验证pET21-EH | 第30-31页 |
| ·获得表达hpRNA 的工程菌株DY-hp | 第31-33页 |
| ·制备DY330 感受态细胞 | 第31页 |
| ·pET21-EH 转化DY330 感受态细胞 | 第31页 |
| ·挑取转化子于液体培养后提取质粒、电泳检测 | 第31页 |
| ·利用DY-hp 发酵并提取hpRNA | 第31-32页 |
| ·DNAaseⅠ、RNase A 酶切验证hpRNA | 第32-33页 |
| ·结果与分析 | 第33-47页 |
| ·TMV 外壳蛋白基因的获得 | 第33-36页 |
| ·烟草总RNA 的检测 | 第33页 |
| ·RT-PCR 产物检测 | 第33-34页 |
| ·质粒检测、cDNA 测序 | 第34-36页 |
| ·构建克隆载体pMD19-EH | 第36-42页 |
| ·引物设计 | 第36页 |
| ·PCR 产物EK326、HK429 的检测 | 第36-37页 |
| ·EK326（-）、HK429（-）的检测 | 第37-38页 |
| ·克隆载体pMD19-EH 的检测及酶切验证 | 第38-39页 |
| ·克隆载体pMD19-EH 测序结果 | 第39-42页 |
| ·构建表达载体pET21-EH | 第42-45页 |
| ·EH（--）检测 | 第42页 |
| ·pET21（--）的检测 | 第42-43页 |
| ·表达载体pET21-EH 酶切验证 | 第43-45页 |
| ·获得表达hpRNA 的工程菌株DY-hp | 第45-47页 |
| ·工程菌株DY-hp 的获得 | 第45页 |
| ·hpRNA 的检测和酶切验证 | 第45-47页 |
| 第三章 菌株DY-hp 发酵hpRNA 的条件优化 | 第47-53页 |
| ·材料 | 第47-48页 |
| ·试剂耗材 | 第47页 |
| ·仪器 | 第47-48页 |
| ·实验内容 | 第48-49页 |
| ·DY-hp 生长曲线的测定 | 第48页 |
| ·IPTG 诱导浓度的优化 | 第48页 |
| ·诱导菌浓的优化 | 第48-49页 |
| ·结果与分析 | 第49-53页 |
| ·DY-hp 生长曲线的测定 | 第49-50页 |
| ·IPTG 最佳诱导浓度 | 第50-51页 |
| ·最佳诱导菌浓 | 第51-53页 |
| 第四章 喷洒hpRNA 处理烟叶 | 第53-58页 |
| ·材料 | 第53-54页 |
| ·试剂耗材 | 第53页 |
| ·仪器 | 第53-54页 |
| ·实验内容 | 第54-56页 |
| ·聚乙二醇提取TMV 颗粒 | 第54页 |
| ·发酵、提取并喷洒hpRNA | 第54页 |
| ·接种TMV | 第54-55页 |
| ·Elisa 检测TMV 病毒 | 第55-56页 |
| ·结果与分析 | 第56-58页 |
| ·聚乙二醇提取TMV 颗粒 | 第56页 |
| ·hpRNA 防治TMV 结果统计 | 第56-58页 |
| 第五章 结论与讨论 | 第58-60页 |
| ·结论 | 第58-59页 |
| ·TMV 外壳蛋白cDNA 序列的获得 | 第58页 |
| ·表达hpRNA 反向重复序列结构的构建 | 第58页 |
| ·工程菌DY-hp 发酵hpRNA 的条件优化 | 第58页 |
| ·喷洒hpRNA 处理烟叶 | 第58-59页 |
| ·讨论 | 第59-60页 |
| ·构建反向重复序列结构方法的通用性 | 第59页 |
| ·hpRNA 的大规模生产应用 | 第59页 |
| ·hpRNA 干扰TMV 的效率 | 第59-60页 |
| 参考文献 | 第60-64页 |
| ABSTRACT | 第64页 |
