| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-11页 |
| 第一章 绪论 | 第11-30页 |
| ·普鲁兰及普鲁兰水解酶 | 第11-14页 |
| ·普鲁兰及普鲁兰水解酶 | 第11-13页 |
| ·普鲁兰酶 | 第13-14页 |
| ·普鲁兰酶的微生物生产及酶学特性 | 第14-19页 |
| ·普鲁兰酶的自然分布 | 第14-15页 |
| ·普鲁兰酶的底物特异性 | 第15页 |
| ·普鲁兰酶与其他淀粉酶脱支酶的差异 | 第15-17页 |
| ·普鲁兰酶的工业应用 | 第17-19页 |
| ·普鲁兰酶的编码基因及蛋白质分子结构 | 第19-21页 |
| ·微生物普鲁兰酶的异源表达 | 第21-22页 |
| ·高效产酶策略 | 第22-25页 |
| ·自诱导培养 | 第22-23页 |
| ·高密度发酵 | 第23-25页 |
| ·普鲁兰酶研究中存在的科学问题及本研究的意义 | 第25-28页 |
| ·关键科学问题 | 第25-27页 |
| ·本研究的目的和意义 | 第27-28页 |
| ·研究思路和内容 | 第28-30页 |
| 第二章 普鲁兰酶生产菌株的筛选、鉴定及产酶特性研究 | 第30-49页 |
| ·前言 | 第30页 |
| ·材料与方法 | 第30-35页 |
| ·土壤样品 | 第30页 |
| ·试剂及仪器 | 第30页 |
| ·培养基与贮液 | 第30-31页 |
| ·微生物的培养方法及培养条件 | 第31-32页 |
| ·酶样的准备、酶活及细胞生物量的测定 | 第32-33页 |
| ·产酶菌株的鉴定 | 第33-34页 |
| ·菌株产酶条件的探索 | 第34-35页 |
| ·结果与讨论 | 第35-48页 |
| ·普鲁兰酶生产菌株的初步筛选 | 第35-37页 |
| ·产酶菌株在液体培养基中复筛 | 第37-38页 |
| ·产酶菌株的鉴定 | 第38-41页 |
| ·Klebsiella sp. SHN-1 产酶条件的研究 | 第41-48页 |
| ·本章小结 | 第48-49页 |
| 第三章 重组普鲁兰酶生产菌株的构建与表达分析 | 第49-61页 |
| ·前言 | 第49页 |
| ·材料与方法 | 第49-54页 |
| ·菌种与质粒 | 第49-50页 |
| ·培养基与溶液 | 第50页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第50-51页 |
| ·Klebsiella sp. SHN-1 的培养及基因组 DNA 的提取 | 第51页 |
| ·普鲁兰酶编码基因的克隆 | 第51页 |
| ·PCR 扩增产物的回收、纯化及浓缩 | 第51-52页 |
| ·PCR 产物与 T-Vector 连接及测序 | 第52页 |
| ·外源基因与质粒 pET-28a 的连接 | 第52-53页 |
| ·感受态细胞的制备及 DNA 转化 | 第53页 |
| ·阳性克隆的挑取及验证 | 第53-54页 |
| ·工程菌株的诱导表达 | 第54页 |
| ·工程菌株胞内外蛋白的 SDS-PAGE 分析 | 第54页 |
| ·酶活及细胞浓度的测定 | 第54页 |
| ·亚细胞组份的制备 | 第54页 |
| ·结果与讨论 | 第54-60页 |
| ·Klebsiella sp. SHN-1 基因组 DNA 的提取及普鲁兰酶编码基因的克隆 | 第54-57页 |
| ·表达系统 E. coli BL21(DE3)/pET-28a-pul 的构建 | 第57-58页 |
| ·工程菌的诱导表达 | 第58-59页 |
| ·重组蛋白在亚细胞部分中的分布 | 第59-60页 |
| ·本章小结 | 第60-61页 |
| 第四章 工程菌普鲁兰酶分泌调控研究 | 第61-72页 |
| ·前言 | 第61页 |
| ·材料与方法 | 第61-63页 |
| ·菌种与质粒 | 第61页 |
| ·培养基与溶液 | 第61-62页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第62页 |
| ·质粒 T-pul 的提取 | 第62页 |
| ·成熟普鲁兰酶编码基因的克隆 | 第62页 |
| ·无信号肽重组表达质粒的构建 | 第62页 |
| ·重组普鲁兰酶生产条件的考察 | 第62-63页 |
| ·重组普鲁兰酶的纯化 | 第63页 |
| ·重组普鲁兰酶酶学性质的考察 | 第63页 |
| ·结果与讨论 | 第63-71页 |
| ·无信号肽编码序列重组表达质粒的构建 | 第63-65页 |
| ·质粒 pET-28a-pul-sig-在大肠杆菌中的诱导表达及重组蛋白分布研究 | 第65-67页 |
| ·工程菌 E. coli BL21 (DE3)/pET-28a-pul-sig-产酶条件的研究 | 第67-69页 |
| ·重组普鲁兰酶纯化及酶学性质研究 | 第69-71页 |
| ·本章小结 | 第71-72页 |
| 第五章 基于自诱导与温度控制策略生产胞外普鲁兰酶 | 第72-90页 |
| ·前言 | 第72页 |
| ·材料与方法 | 第72-74页 |
| ·菌株 | 第72页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第72页 |
| ·储液和培养基 | 第72-73页 |
| ·固体自诱导培养基可视化筛选稳定克隆子 | 第73页 |
| ·培养方法与条件 | 第73页 |
| ·细胞浓度与生物量的测定 | 第73页 |
| ·生长曲线的绘制 | 第73页 |
| ·普鲁兰酶酶活的测定 | 第73-74页 |
| ·质粒稳定性的测定 | 第74页 |
| ·发酵液中底物与产物的 HPLC 分析 | 第74页 |
| ·不同细胞渗透物对胞外普鲁兰酶产量的影响 | 第74页 |
| ·分批发酵产胞外普鲁兰酶 | 第74页 |
| ·分批补料发酵生产胞外普鲁兰酶 | 第74页 |
| ·胞外普鲁兰酶样品的制备及 SDS-PAGE | 第74页 |
| ·结果与讨论 | 第74-88页 |
| ·可视化筛选高产胞外普鲁兰酶克隆子 | 第74-77页 |
| ·种龄时机的选择 | 第77-78页 |
| ·自诱导培养生产胞外普鲁兰酶 | 第78-81页 |
| ·双温度调控策略高效生产胞外普鲁兰酶 | 第81-83页 |
| ·细胞渗透物对胞外普鲁兰酶产量的影响 | 第83-86页 |
| ·发酵罐水平发酵生产胞外普鲁兰酶 | 第86-88页 |
| ·本章小结 | 第88-90页 |
| 主要结论与展望 | 第90-93页 |
| 主要结论 | 第90-91页 |
| 展望 | 第91-93页 |
| 论文主要创新点 | 第93-94页 |
| 致谢 | 第94-95页 |
| 参考文献 | 第95-108页 |
| 附录：图（表） | 第108-111页 |
| 附录：作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第111页 |
