| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-17页 |
| 英文缩略表 | 第17-18页 |
| 第一章 文献综述 | 第18-28页 |
| ·隐孢子虫生活史 | 第18-19页 |
| ·隐孢子虫致病性 | 第19-20页 |
| ·隐孢子虫基因组学 | 第20-21页 |
| ·粘附因子 | 第21-23页 |
| ·烯醇酶蛋白简介 | 第23-26页 |
| ·烯醇酶的性质 | 第23-24页 |
| ·烯醇酶在顶复门寄生虫的作用和功能 | 第24-26页 |
| ·烯醇酶在球虫中的功能 | 第24-25页 |
| ·烯醇酶在弓形虫中的功能 | 第25页 |
| ·烯醇酶在疟原虫中的功能 | 第25-26页 |
| ·EF手性蛋白简介 | 第26-27页 |
| ·典型EF手性蛋白-钙调蛋白(Camodulin protein,CaM)的结构特性 | 第26页 |
| ·EF手性蛋白的作用机理 | 第26页 |
| ·EF手性蛋白在顶复门寄生虫的功能作用 | 第26-27页 |
| ·类钙调蛋白(calmodulin-like protein,CML)在其他物种中的作用 | 第27页 |
| ·研究微小隐孢子虫Enolase和CML的目的与意义 | 第27-28页 |
| 第二章 微小隐孢子虫烯醇酶基因的原核表达及多克隆抗体的制备 | 第28-47页 |
| ·材料与方法 | 第28-33页 |
| ·载体、菌株和微小隐孢子虫卵囊cDNA | 第28-29页 |
| ·主要试剂 | 第29页 |
| ·主要溶剂的配制 | 第29-32页 |
| ·重组质粒构建与鉴定所需试剂的配制 | 第29-30页 |
| ·核酸电泳试剂的配制 | 第30页 |
| ·SDS-PAGE所需试剂配制 | 第30-31页 |
| ·Western blot试剂配制 | 第31页 |
| ·纯化蛋白与ELISA实验所需试剂 | 第31-32页 |
| ·主要仪器 | 第32-33页 |
| · | 第33-40页 |
| ·引物设计 | 第33页 |
| ·Enolase基因扩增 | 第33-34页 |
| ·PCR | 第33-34页 |
| ·12g/L琼脂糖凝胶电泳 | 第34页 |
| ·PCR产物纯化回收 | 第34页 |
| ·PCR扩增产物的克隆、鉴定及其氨基酸序列的分析 | 第34-35页 |
| ·目的DNA与克隆载体的连接 | 第34页 |
| ·重组质粒pMD-Enolase的转化 | 第34页 |
| ·重组质粒pMD-Enolase的鉴定 | 第34-35页 |
| ·重组质粒pMD-Enolase菌液PCR初步鉴定 | 第34-35页 |
| ·重组质粒pMD-Enolase双酶切鉴定 | 第35页 |
| ·Enolase氨基酸序列的分析 | 第35页 |
| ·重组质粒pET28a-Enolase的诱导表达及纯化 | 第35-39页 |
| ·重组原核表达质粒pET 28a-Enolase的构建及鉴定 | 第35-36页 |
| ·pET28a(+)空质粒的提取 | 第35页 |
| ·pET28a(+)质粒的双酶切 | 第35页 |
| ·目的DNA与原核表达载体的连接 | 第35-36页 |
| ·重组原核表达质粒pET28a-Enolase的转化 | 第36页 |
| ·重组原核表达质粒pET28a-Enolase的鉴定 | 第36页 |
| ·重组原核表达质粒pET28a-Enolase的诱导表达 | 第36-38页 |
| ·高效表达菌株的选取分析 | 第36页 |
| ·不同时间的诱导表达时相分析 | 第36-37页 |
| ·不同表达形式的分析 | 第37页 |
| ·SDS-PAGE分析 | 第37-38页 |
| ·原核细胞BL21(DE3)表达产物的纯化 | 第38-39页 |
| ·重组蛋白rEnolase的Western blot分析 | 第39页 |
| ·多克隆抗体的制备及鉴定 | 第39-40页 |
| ·融合蛋白rEenolase免疫兔血清(多克隆抗体)的制备 | 第39-40页 |
| ·融合蛋白rEnolase免疫兔血清的Western blot鉴定 | 第40页 |
| ·结果 | 第40-46页 |
| ·Enolase基因的扩增 | 第40-41页 |
| ·重组质粒pMD-Enolase的鉴定及其氨基酸序列分析 | 第41-42页 |
| ·重组原核表达质粒pET28a-Enolase的鉴定 | 第42页 |
| ·重组质粒pET28a-Enolase转化菌的诱导表达及表达产物的纯化 | 第42-44页 |
| ·融合蛋白rEnolase的Western blot分析 | 第44-45页 |
| ·多克隆抗体效价的测定及Western blot鉴定 | 第45-46页 |
| ·多克隆抗体效价的测定 | 第45页 |
| ·多克隆抗体的Western blot分析 | 第45-46页 |
| ·讨论 | 第46-47页 |
| 第三章 微小隐孢子虫rEnolase活性测定及Enolase在卵囊上定位初步研究 | 第47-56页 |
| ·材料与方法 | 第47页 |
| ·主要试剂 | 第47页 |
| ·主要溶液的配制 | 第47页 |
| ·主要仪器 | 第47页 |
| ·实验方法 | 第47-49页 |
| ·rEnolase的制备 | 第47-48页 |
| ·酶活测定 | 第48页 |
| ·rEnolase米氏常数(Michaelis constant,K_m)的测定 | 第48页 |
| ·外界因素对rEnolase酶活的影响 | 第48-49页 |
| ·不同pH对rEnolase酶活的影响 | 第48页 |
| ·不同温度对rEnolase酶活的影响 | 第48页 |
| ·不同浓度离子对rEnolase酶活的影响 | 第48-49页 |
| ·不同浓度Na~+离子对rEnolase酶活的影响 | 第48-49页 |
| ·不同浓度K~+离子对rEnolase酶活的影响 | 第49页 |
| ·不同浓度Mg~(2+)离子对rEnolase酶活的影响 | 第49页 |
| ·Enolase在微小隐孢子卵囊上的定位 | 第49页 |
| ·结果 | 第49-53页 |
| ·酶学活性测定 | 第49-50页 |
| ·rEnolase米氏常数 | 第50页 |
| ·外界因素对rEnolase酶活的影响 | 第50-53页 |
| ·不同pH对rEnolase酶活的影响 | 第50-51页 |
| ·不同温度对rEnolase酶活的影响 | 第51页 |
| ·不同浓度离子对rEnolase酶活的影响 | 第51-53页 |
| ·不同浓度Na~+离子对rEnolase酶活的影响 | 第51-52页 |
| ·不同浓度K~+离子对rEnolase酶活的影响 | 第52页 |
| ·不同浓度Mg~(2+)离子对rEnolase酶活的影响 | 第52-53页 |
| ·Enolase在C parvum卵囊上的定位 | 第53页 |
| ·讨论 | 第53-56页 |
| 第四章 微小隐孢子虫类钙调蛋白基因真核表达质粒的构建及在Hela细胞中的表达 | 第56-68页 |
| ·材料与方法 | 第56-57页 |
| ·载体、菌株、细胞和cDNA | 第56页 |
| ·主要试剂 | 第56-57页 |
| ·主要溶液的配制 | 第57页 |
| ·重组质粒构建与鉴定所需试剂配制 | 第57页 |
| ·核酸电泳试剂的配制 | 第57页 |
| ·SDS-PAGE所需试剂配制 | 第57页 |
| ·Western blot试剂配制 | 第57页 |
| ·主要仪器 | 第57页 |
| ·实验方法 | 第57-62页 |
| ·引物设计 | 第57页 |
| ·CML~e基因扩增 | 第57-58页 |
| ·PCR | 第57-58页 |
| ·12g/L琼脂糖凝胶电泳 | 第58页 |
| ·PCR产物纯化回收 | 第58页 |
| ·PCR扩增产物的克隆、鉴定及序列的生物信息学分析 | 第58-59页 |
| ·目的DNA与克隆载体的连接 | 第58页 |
| ·重组质粒pMD-CML~e的转化 | 第58页 |
| ·重组质粒pMD-CML~e的鉴定 | 第58-59页 |
| ·重组质粒pMD-CML~e菌液PCR初步鉴定 | 第58-59页 |
| ·重组质粒pMD-CML~e双酶切鉴定 | 第59页 |
| ·CML基因序列鉴定与序列的生物信息学分析 | 第59页 |
| ·重组真核表达质粒的构建及鉴定 | 第59-61页 |
| ·pVAX1质粒的小量提取 | 第59页 |
| ·pVAX1质粒的双酶切 | 第59页 |
| ·目的DNA与真核表达载体的连接 | 第59-60页 |
| ·重组真核表达质粒pVAX-CML的转化 | 第60页 |
| ·重组重组真核表达质粒pVAX-CML的鉴定 | 第60-61页 |
| ·pVAX-CML菌液PCR初步鉴定 | 第60页 |
| ·pVAX-CML双酶切鉴定 | 第60页 |
| ·不含内毒素的重组表达质粒pVAX-CML和质粒pVAX1中量提取 | 第60-61页 |
| ·Hela细胞瞬时转染 | 第61-62页 |
| ·细胞培养 | 第61页 |
| ·转染 | 第61-62页 |
| ·重组质粒pVAX-CML在Hela细胞中的表达检测和分析 | 第62页 |
| ·Western blot分析 | 第62页 |
| ·间接免疫荧光检测 | 第62页 |
| ·结果 | 第62-65页 |
| ·CML~e基因的扩增 | 第62页 |
| ·重组质粒pMD-CML~e的鉴定和序列分析 | 第62-64页 |
| ·重组真核表达质粒pVAX-CML的鉴定 | 第64页 |
| ·Western blot分析结果 | 第64-65页 |
| ·间接免疫荧光检测 | 第65页 |
| ·讨论 | 第65-68页 |
| 第五章 微小隐孢子虫类钙调蛋白基因的原核表达 | 第68-78页 |
| ·材料与方法 | 第68-69页 |
| ·载体、菌株和cDNA | 第68页 |
| ·主要试剂 | 第68页 |
| ·主要试剂的配制 | 第68-69页 |
| ·重组质粒构建与鉴定所需试剂配制 | 第68页 |
| ·核酸电泳试剂的配制 | 第68-69页 |
| ·蛋白表达纯化试剂的配制 | 第69页 |
| ·SDS-PAGE所需试剂配制 | 第69页 |
| ·Western blot试剂配制 | 第69页 |
| ·主要仪器 | 第69页 |
| ·实验方法 | 第69-73页 |
| ·引物设计 | 第69页 |
| ·CML基因扩增 | 第69-70页 |
| ·PCR | 第69-70页 |
| ·12g/L琼脂糖凝胶电泳 | 第70页 |
| ·PCR产物纯化回收 | 第70页 |
| ·PCR扩增产物的克隆与鉴定 | 第70页 |
| ·目的DNA与克隆载体的连接 | 第70页 |
| ·重组质粒pMD-CML的转化 | 第70页 |
| ·重组质粒pMD-CML的鉴定 | 第70页 |
| ·重组质粒pMD-CML菌液PCR初步鉴定 | 第70页 |
| ·重组质粒pMD-CML双酶切鉴定 | 第70页 |
| ·重组质粒pGEX-CML的诱导表达及纯化 | 第70-73页 |
| ·重组原核表达质粒的构建及鉴定 | 第70-71页 |
| ·pGEX-6p-1质粒的提取 | 第70页 |
| ·pGEX-6p-1质粒的双酶切 | 第70页 |
| ·目的DNA与原核表达载体的连接 | 第70-71页 |
| ·重组原核表达质粒pGEX-CML的转化 | 第71页 |
| ·重组原核表达质粒pGEX-CML的鉴定 | 第71页 |
| ·重组原核表达质粒pGEX-CML的诱导表达 | 第71-72页 |
| ·高效表达菌株的选取分析 | 第71页 |
| ·不同时间的诱导表达时相分析 | 第71页 |
| ·不同表达形式的分析 | 第71-72页 |
| ·SDS-PAGE分析 | 第72页 |
| ·原核细胞BL21(DE3)表达产物的纯化 | 第72-73页 |
| ·纯化产物的Western blot分析 | 第73页 |
| ·SDS-PAGE分析 | 第73页 |
| ·Western blot分析 | 第73页 |
| ·结果 | 第73-77页 |
| ·CML基因的扩增 | 第73页 |
| ·重组质粒pMD-CML的鉴定 | 第73-74页 |
| ·重组真核表达质粒pGEX-CML的鉴定 | 第74页 |
| ·重组质粒pGEX-CML的诱导表达及纯化 | 第74-76页 |
| ·重组蛋白rCML的Western blot分析 | 第76-77页 |
| ·讨论 | 第77-78页 |
| 第六章 全文结论 | 第78-79页 |
| 参考文献 | 第79-89页 |
| 致谢 | 第89-90页 |
| 作者简历 | 第90页 |
