| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-10页 |
| 第一章 文献综述 | 第10-24页 |
| 1 Piwi(P-element induced wimpy testes)基因的研究进展 | 第10-12页 |
| 2 亚细胞定位研究 | 第12-14页 |
| ·亚细胞定位概述 | 第12页 |
| ·免疫胶体金标记 | 第12-13页 |
| ·免疫荧光 | 第13页 |
| ·GFP在亚细胞定位研究中的应用 | 第13-14页 |
| 3 PGCs细胞 | 第14-17页 |
| ·原始生殖细胞(Primordial Germ Cells,PGCs)概述 | 第14页 |
| ·PGCs体外的获取与纯化 | 第14-15页 |
| ·鸡PGCs细胞的鉴定 | 第15-16页 |
| ·形态学鉴定 | 第15页 |
| ·过碘酸希夫氏(periodic acid-Schiff,PAS)特异性染色检测 | 第15页 |
| ·碱性磷酸酶活性(AKP)检测 | 第15-16页 |
| ·胚胎阶段特异性胚胎表面抗原(Stage Specific Embryonic Antigen-1,SSEA-1)检测 | 第16页 |
| ·端粒酶反转录酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)活性检测 | 第16页 |
| ·PGCs体外培养 | 第16-17页 |
| ·饲养层对PGCs生长的重要性 | 第16-17页 |
| ·不同细胞因子对PGCs细胞体外培养的影响 | 第17页 |
| ·白血病抑制因子(Leukemia Inhibitory Factor) | 第17页 |
| ·干细胞生长因子(Stem Cell Factor) | 第17页 |
| ·碱性成纤维细胞生长因子(basie-Fibroblast Growth Factor) | 第17页 |
| 4 RNA干扰技术 | 第17-19页 |
| 5 荧光定量技术 | 第19-20页 |
| ·概述 | 第19页 |
| ·原理 | 第19页 |
| ·Real-time qPCR种类 | 第19-20页 |
| ·Taqman(?) 探针法 | 第19-20页 |
| ·SYBR(?) Green法 | 第20页 |
| 6 鸡PGCs中与干细胞多能性和配子发生相关基因的研究 | 第20-21页 |
| ·CVH(Chicken vasa homologue)研究进展 | 第20页 |
| ·Dazl(Deleted in azoospermia-like)研究进展 | 第20-21页 |
| ·Nanog基因的研究进展 | 第21页 |
| ·Sox2基因的研究进展 | 第21页 |
| 7 鸡胚模型在生命科学研究中的应用 | 第21-23页 |
| 8 本研究目的和意义 | 第23-24页 |
| 第二章 Piwi基因亚细胞定位研究 | 第24-33页 |
| 1 实验材料 | 第24-25页 |
| ·实验动物 | 第24页 |
| ·主要仪器 | 第24页 |
| ·主要试剂 | 第24-25页 |
| 2 实验方法 | 第25-28页 |
| ·总RNA的制备(Trizol法提取总RNA) | 第25页 |
| ·引物设计与合成 | 第25页 |
| ·Piwi基因cDNA的扩增 | 第25-27页 |
| ·融合表达载体pEGFP-C1-Piwi的构建和转染 | 第27页 |
| ·融合表达载体pcDNA 3.1-Piwi的构建和转染 | 第27页 |
| ·细胞固定、染色观察及照像(pcDNA 3.1-Piwi转染) | 第27页 |
| ·PIWI蛋白的初级结构及其亚细胞定位预测 | 第27-28页 |
| 3 实验结果 | 第28-31页 |
| ·总RNA提取及RNA完整性检测 | 第28页 |
| ·重组载体pM D19-T-Piwi鉴定 | 第28页 |
| ·融合表达载体pEGFP-C1-Piwi的鉴定 | 第28-29页 |
| ·融合表达载体pcDNA3.1-Piwi的鉴定 | 第29页 |
| ·PIWI蛋白的初级结构及其亚细胞定位 | 第29-30页 |
| ·pEGFP-C1-Piwi转染NIH-3T3细胞的检测结果 | 第30页 |
| ·间接免疫荧光 | 第30-31页 |
| 4 讨论 | 第31-33页 |
| 第三章 体外沉默Piwi基因及其对配子发生和干细胞多能性调控因子的影响 | 第33-49页 |
| 1 实验材料 | 第33页 |
| ·实验动物 | 第33页 |
| ·实验仪器 | 第33页 |
| ·实验试剂 | 第33页 |
| 2 实验方法 | 第33-40页 |
| ·shRNAs的设计与合成 | 第33-35页 |
| ·靶序列选取 | 第33-34页 |
| ·pRNA-U6.1/Neo-shRNA构建 | 第34-35页 |
| ·鸡PGCs的分离 | 第35-38页 |
| ·饲养层的制备 | 第35-37页 |
| ·鸡胚成纤维细胞(chicken embryonic fibroblast,CEFs)原代培养 | 第35页 |
| ·鸡胚成纤维细胞的传代培养 | 第35-36页 |
| ·鸡胚胎成纤维细胞的冻存 | 第36页 |
| ·鸡胚胎成纤维细胞的复苏 | 第36-37页 |
| ·饲养层的制备 | 第37页 |
| ·鸡PGCs的培养 | 第37-38页 |
| ·鸡PGCs的分离与原代培养 | 第37页 |
| ·鸡原始生殖细胞传代培养 | 第37-38页 |
| ·鸡PGCs的鉴定方法 | 第38页 |
| ·细胞形态学鉴定 | 第38页 |
| ·过碘酸希夫氏(periodic acid-Schiff,PAS)染色 | 第38页 |
| ·碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)活性检测 | 第38页 |
| ·端粒酶反转录酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)抗体鉴定 | 第38页 |
| ·阶段特异性胚胎抗原(stage-specific embryonic antigen-1,SSEA-1)鉴定 | 第38页 |
| ·CEFs与PGCs目的基因扩增 | 第38页 |
| ·Piwi-shRNA特异序列的转染 | 第38-39页 |
| ·转染效率的检测 | 第39页 |
| ·Real-Time qPCR检测 | 第39-40页 |
| ·数据分析 | 第40页 |
| 3 结果 | 第40-45页 |
| ·shRNAs质粒的PCR检测 | 第40-41页 |
| ·PGCs鉴定 | 第41-43页 |
| ·形态学鉴定 | 第41页 |
| ·PAS糖原染色 | 第41-42页 |
| ·AKP活性检测 | 第42页 |
| ·TERT抗体鉴定 | 第42-43页 |
| ·SSEA-1鉴定 | 第43页 |
| ·饲养层的制备 | 第43页 |
| ·原代PGCs分离 | 第43页 |
| ·转染效率的检测 | 第43-44页 |
| ·CEFs与PGCs目的基因扩增 | 第44页 |
| ·shRNA抑制Piwi的表达 | 第44-45页 |
| ·沉默Piwi基因的PGCs中CVH、Dazl、Nanog、Sox2的表达 | 第45页 |
| 4 讨论 | 第45-49页 |
| 第四章 体内抑制Piwi基因及对配子发生和干细胞多能性调控因子的影响的表达(鸡胚水平) | 第49-56页 |
| 1 实验材料 | 第49页 |
| ·实验动物 | 第49页 |
| ·实验仪器 | 第49页 |
| ·实验试剂 | 第49页 |
| 2 实验方法 | 第49-51页 |
| ·实验准备 | 第49-50页 |
| ·转染液的配制 | 第49页 |
| ·蛋壳制备 | 第49页 |
| ·预处理 | 第49页 |
| ·去壳 | 第49-50页 |
| ·封口 | 第50页 |
| ·孵化条件 | 第50页 |
| ·不同生命阶段鸡胚性腺组织的采集 | 第50页 |
| ·不同日龄鸡胚存活率统计 | 第50页 |
| ·总RNA的制备 | 第50页 |
| ·cDNA第一条链的合成(SYBR Green Assay) | 第50-51页 |
| ·Real-Time qPCR检测 | 第51页 |
| ·数据分析 | 第51页 |
| 3 实验结果 | 第51-53页 |
| ·目的基因扩增 | 第51页 |
| ·鸡胚孵化率检测 | 第51-52页 |
| ·shRNA抑制Piwi的表达 | 第52页 |
| ·沉默Piwi基因的鸡胚中CVH、Dazl、及Nanog、Sox2的表达 | 第52-53页 |
| 4 讨论 | 第53-56页 |
| 全文结论 | 第56-57页 |
| 参考文献 | 第57-65页 |
| 致谢 | 第65-66页 |
| 攻读学位期间发表学术论文目录 | 第66-68页 |
